路万虹，张晓田，成少利，施秉银

(西安交通大学：1. 第一附属医院肾脏内科；2. 基础医学院；3.第一附属医院内分泌科，陕西西安 710061)



复方丹参滴丸对大鼠糖尿病肾病早期的肾脏保护及作用机制

路万虹1，张晓田2，成少利2，施秉银3

(西安交通大学：1. 第一附属医院肾脏内科；2. 基础医学院；3.第一附属医院内分泌科，陕西西安 710061)

目的 探讨复方丹参滴丸对早期糖尿病肾病的保护作用及可能机制。方法 腹腔注射链脲佐菌素建立高血糖大鼠动物模型。造模成功的大鼠随机分为模型组、复方丹参组以及厄贝沙坦组，分别给予蒸馏水、复方丹参滴丸及厄贝沙坦灌胃。另设正常对照组以同体积蒸馏水灌胃。测定尿白蛋白、血肌酐及血糖；肾脏组织行PAS、Masson染色，电镜观察超微结构，免疫组化检测肾组织血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达。结果 复方丹参滴丸大剂量时可减少尿白蛋白排泄率、减轻肾脏的病理变化。降低肾小球VEGF、CTGF、MCP-1蛋白表达水平。结论 复方丹参滴丸能有效改善糖尿病所致的肾脏损害，其保护作用可能与降低生长因子和炎症因子有关。

复方丹参滴丸；糖尿病肾病；尿白蛋白排泄率；血管内皮生长因子；结缔组织生长因子；巨噬细胞趋化蛋白-1

我国20岁以上人群中，糖尿病及糖尿病前期的发病率高达9.7%及15.5%[1]。糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病最常见、最严重的慢性微血管并发症之一。DKD的发生发展是多因素综合作用的结果，各种生长因子、炎症趋化因子以及细胞通路间的交互作用尤为重要。无论是1型还是2型糖尿病，其肾脏损害相似[2]，累及肾脏实质和间质各种细胞。DKD的病理生理改变为肾小球高滤过、微量白蛋白尿(microalbuminuria, MAU)以及随之而发生的肾功能恶化。这种病理生理过程与肾小球、肾小管间质细胞及细胞外结构功能紊乱相关[3]。早中期DKD的病理改变包括肾小球肥大、基底膜轻度增厚、系膜基质轻度增宽，肾小管上皮细胞出现空泡变性及颗粒变性，肾间质及小动脉尚无明显病变；随着疾病进展，进而出现肾小球硬化，肾小管间质纤维化、肾小管萎缩等间质改变[4]。通过治疗可延缓和逆转肾脏病理改变并改善肾功能异常指标。本研究探讨复方丹参滴丸治疗DKD对肾功能的改善和肾脏病理改变的延缓及逆转作用以及可能的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 糖尿病模型造模与分组

SD大鼠造模按照60 mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，1周时随机血糖≥16.7 mmol/L，即为糖尿病模型造模成功[5-6]；糖尿病模型大鼠应用长效胰岛素皮下注射，控制血糖于20～27 mmol/L之间。

常规喂养12周开始分组干预，至第24周末。模型大鼠随机分为3组：糖尿病对照组(DC组，n=10)每日给予蒸馏水灌胃；复方丹参滴丸组(CDDP组，n=10)，500 mg/(kg·d)复方丹参滴丸灌胃；厄贝沙坦组(IRS组，n=10)，50 mg/(kg·d)厄贝沙坦灌胃。另外，设立正常对照组大鼠(NC组，n=10)，每日给予相应体积的蒸馏水灌胃。

1.2 标本的留取

于实验干预起点及24周末，收集各组大鼠尿液并记录24 h尿量。腹腔注射100 g/L水合氯醛(0.3～0.4 mL/100 g体质量)麻醉，经心脏取血留存。迅速摘除两侧肾脏，分别进行超微结构观察和各种染色。

1.3 生化指标检测

留取的血标本用于测定血糖和肾功指标；尿标本用于测定24 h尿微量白蛋白排泄率(放射免疫法)。尿微量白蛋白排泄率(UAER)变化倍数：药物干预及观察终点(24周)及起点(12周)UAER的比值(UAER24周/UAER12周)。

1.4 肾组织标本处理与电镜检测及各种染色

将左肾上极取4～5块1 mm3组织置于25 mL/L戊二醛固定液固定，常规制作超薄切片，用于电子显微镜检查。

左肾其余部分经横断面切开后置于乙醇-甲醛-醋酸固定液固定，分别用于常规PAS、Masson，并同时进行免疫组化染色检测血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)蛋白表达。免疫组化染色具体步骤为，组织石蜡切片常规脱蜡后，采用30 mL/L H2O2封闭，微波热修复抗原10 min。羊血清于37 ℃恒温封闭1 h后，依次滴加一抗(1∶500稀释)，4 ℃过夜，以PBS漂洗，再滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1∶500稀释)恒温孵育，然后经DAB 显色和苏木素复染，于显微镜下观察结果。

1.5 图像分析及数据测定

1.5.1 肾小球基底膜厚度测定及肾小球面积计算 在各个实验组大鼠中随机选择2只大鼠肾组织进行电子显微镜观察及照像，每只大鼠选取相互不重叠的15个视野，通过图像分析系统，测定肾小球基底膜厚度，每组取其平均值。在每例切片中寻找并选择血管极和尿极均切到的肾小球，计算出所选肾小球的相对面积(μm2)，每组取其平均值。

1.5.2 肾小球系膜区面积计算 PAS染色中，每例肾组织切片在高倍镜下随机观察10个肾小球，应用图像分析系统选择PAS阳性物质的红染区域，计算肾小球系膜及基底膜面积所占肾小球球丛总面积的百分比，每组取其平均值。

1.5.3 肾间质胶原纤维组织面积计算 Masson染色中，每例切片低倍镜下(×100)随机观察10个相互不重叠的肾小管区域视野，计算肾间质胶原纤维组织面积占整个视野的百分比，每组取其平均值。

1.5.4 免疫组化结果半定量分析 每张切片随机选5 个含肾小球的不重复视野(×400)，计算机自动测定并计算阳性染色累积吸光度(IA)值和阳性染色的面积(area)，分别取其平均值进行分析，蛋白相对量以平均吸光度(IA/area)表示。

以上测量均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统照像并计算。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 造模结果

共196只大鼠STZ腹腔注射进行糖尿病造模，其中143只造模大鼠在1周时血糖≥16.7 mmol/L确定为造模成功，成功率73.0%。实验24周结束时，DC组死亡2只，剩余8只；CDDP组死亡1只，剩余9只；IRS组死亡2只，剩余8只，NC组无死亡，为10只。

2.2 血糖、尿素氮和肌酐的检测结果

第24周末，监测NC组大鼠血糖为(5.88±0.37)mmol/L，DC组、CDDP组、IRS组大鼠的血糖较NC组大鼠均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；后3组大鼠均需应用胰岛素皮下注射控制血糖于20～27 mmol/L，3组间血糖差异无统计学意义(P=0.932)。

与NC组相比，DC组与IRS组的血清尿素氮水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；而CDDP组血清尿素氮较NC组有所上升，但差异无统计学意义(P=0.150)；CDDP组血清肌酐水平较NC组有显著下降(P<0.01)，较DC组也明显下降(P<0.05)，差异有统计学意义(表1)。

2.3 尿UAER的变化及比较

第12周时，各干预组及模型组UAER水平较NC组显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，各干预组及模型组大鼠组间UAER水平差异无统计学意义。至24周时，各干预组及模型组大鼠UAER明显升高，UAER变化倍数均较NC组有明显上升，差异有统计学意义(表2)。组间比较结果显示，DC组大鼠UAER上升程度最为显著，而CDDP组与IRS组UAER虽仍有明显上升，但其升高程度显著低于DC组，差异有统计学意义(P<0.01)；3组中以IRS组的上升程度较小，CDDP组次之，这两组间的UAER变化倍数未显示出统计学意义(P=0.357，表2)。

表1 各组大鼠24周时血糖、血尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)的比较

Tab.1 Comparison of BS, BUN and SCr at week 24 in different groups

组别血糖(mmol/L)BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)正常对照组5.88±0.377.35±0.6871.30±8.46糖尿病组25.37±3.24*10.03±0.76*70.25±10.55复方丹参滴丸组24.95±5.95*8.08±1.0452.34±8.36#△厄贝沙坦组26.40±4.91*10.63±0.62*62.65±6.25

与正常对照组比较，*P<0.0001；与正常对照组比较，#P=0.002；与糖尿病组比较，△P=0.025。

表2 各组尿微量白蛋白排泄率的比较

Tab.2 Comparison of UAER between different groups

组别UAER(mg/24h,Median,25per,75per)12周24周UAER变化倍数(x±s)正常对照组(NC)0.1505,0.1132,0.17570.1702,0.1167,0.19281.14±0.39糖尿病组(DC)0.7411*,0.3354,0.54793.4437*,1.6279,5.44774.25±1.78**复方丹参滴丸组(CDDP)0.7951*,0.5133,1.10162.2822*,0.9579,2.84962.45±0.82##△厄贝沙坦组(IRS)0.7803*,0.4354,1.25221.1709*,0.8761,2.32441.87±0.48#△

DC、CDDP、IRSvs. NC，*P=0.006；DCvs. NC，**P=0.0001；IRSvs. NC，#P=0.024；CDDPvs. NC，##P=0.010；CDDPvs. DC，△P<0.01,P=0.008；IRSvs. DC，P=0.001。

2.4 肾脏超微病理改变

DC组大鼠肾脏基质增多，基底膜增厚。足细胞肿胀，足突融合、脱落。肾小管管腔缩小。IRS组大鼠肾小球结构尚可，基质轻度增多，基底膜轻度增厚。足细胞可见部分足突融合现象。肾小管管腔开放良好。CDDP组大鼠肾基质有所增多，基底膜节段性增厚。足细胞易见足突融合现象，较IRS组明显。肾小管管腔开放良好(图1)。

图1 各组大鼠肾脏超微结构的变化

Fig.1 The ultrastructure of rat kidney in different groups
A：正常对照组；B：糖尿病组；C：复方丹参滴丸组；D：厄贝沙坦组。

2.5 光镜下肾脏病理改变

观察24周后，可见NC组大鼠肾小球及肾小管结构清晰，肾小管管腔开放良好；DC组大鼠肾脏毛细血管腔形态不规则、开放减少，系膜细胞数局部增多、系膜区基质明显增宽、基底膜明显增厚；CDDP组、IRS组与DC组相比，系膜细胞增生及基质增宽程度减少，但与NC组大鼠相比仍有所增多。PAS染色结果显示NC组大鼠肾小球及肾小管结构清晰，小球毛细血管腔开放良好，系膜区不宽，系膜细胞数1～2个，偶见局部系膜细胞增生表现，肾小管排列整齐，管腔通畅；DC组大鼠肾脏毛细血管腔不规则、开放减少，系膜细胞明显增多、系膜区明显增宽、PAS阳性物质沉积明显增加，基底膜增厚；CDDP组、IRS组与DC组相比系膜细胞增生减少，PAS阳性物质的沉积也减少，但与NC组大鼠相比仍增多。Masson染色结果显示各组大鼠间质肾小管排列整齐，间质胶原纤维有所增多，未见明显的肾小管萎缩、扩张及炎细胞浸润等改变(图2)。

图2 各组大鼠肾脏PAS染色和Masson染色的比较

Fig.2 Comparison of PAS- and Masson-stained renal structures in different groups
标尺：肾小球(PAS染色)100 μm，间质(Masson染色)200 μm。

2.6 肾小球基底膜厚度、肾小球面积及肾小管间质胶原纤维的变化

与NC组大鼠基底膜厚度(256.99±17.55)nm相比，模型及各干预组均显著增厚(P<0.01)；IRS组为(306.30±32.67)nm，增厚程度较小，CDDP组次之，为(356.32±45.45)nm，DC组增厚程度最为明显，为(456.63±95.18)nm；IRS和CDDP组基底膜增厚程度较DC组明显减小，差异有统计学意义(P<0.01)；IRS组与CDDP组相比，IRS组基底膜增厚程度更小，差异有统计学意义(P<0.05)。

IRS组[(10 859.18±872.66)μm3]大鼠的肾小球横断面积与NC组[(10 818.80±803.46)μm3]相比，差异无统计学意义(P>0.05)，DC组[(11 768.43±841.55)μm3]及CDDP组[(12 358.79±989.62)μm3]肾小球面积较NC组明显增加，差异有统计学意义(P分别为0.006，0.000，即P<0.01)。与DC组相比，IRS组肾小球面积有明显减小，差异有统计学意义(P=0.045，即P<0.05)，CDDP组较DC组肾小球面积稍大，但差异无统计学意义(P>0.05)。

糖尿病及各干预组大鼠的肾小管间质胶原纤维面积比例均较NC组[(7.18±1.67)%]明显增多(P<0.01)，DC组[(15.86±4.04)%]大鼠胶原纤维增加的程度最为明显； IRS组[(11.55±2.34)%]胶原纤维比例与DC组相比减少，有明显改善，差异有统计学意义(P<0.01)，IRS组对胶原纤维比例的改善也优于CDDP组[(14.29±3.16)%](P<0.01)，CDDP组的胶原纤维比例较DC组有所减少，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.7 免疫组化结果

CTGF、MCP-1在近端肾小管、肾小球细胞胞质中有表达。NC组大鼠的3个细胞因子在肾小球中表达水平较低，CTGF、MCP-1的表达很弱(图3)。糖尿病及各干预组大鼠的肾小球VEGF、CTGF、MCP-1的表达水平与NC组相比均明显增高，以DC组的增高程度最为显著(P<0.01)。

与NC组比较，DC组、CDDP组的VEGF增高程度很明显(P<0.01)，IRS组也有明显增高，但程度稍低(P<0.05)；与DC组相比，IRS和CDDP的VEGF平均吸光度值显著降低(P<0.05)，以IRS的降低更为明显(P<0.01)，差异有统计学意义(表3)。

与NC组比较，糖尿病及各干预组大鼠的CTGF均显著增高，DC组的增高最明显(P<0.01)；与DC组比较，IRS组和CDDP组CTGF水平有显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

与NC组相比，糖尿病及各干预组大鼠的MCP-1均显著增高(P<0.01)，DC组的增高最明显；与DC组相比，IRS组和CDDP组MCP-1的增高程度明显降低，有显著改善，差异有统计学意义(P<0.01)，IRS组与CDDP组相比，3种细胞因子表达水平的改善以IRS组更显著，但差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

图3 各组大鼠肾脏VEGF、CTGF、MCP-1的表达变化

Fig.3 Expressions of VEGF, CTGF and MCP-1 in rat kidney of different groups (×400)

表3 糖尿病肾病相关细胞因子半定量分析结果(平均吸光度值IA)的比较

组别VEGFCTGFMCP-1正常对照组1.15±0.160.071±0.0480.112±0.053糖尿病组1.69±0.17**0.195±0.058**0.397±0.071**复方丹参滴丸组1.47±0.19**△0.141±0.051*△0.300±0.057**△△厄贝沙坦组1.31±0.13*△△0.128±0.061*△0.287±0.068**△△

与正常对照组比较，*P<0.05；**P<0.01；与糖尿病组比较，△P<0.05；△△P<0.01。

3 讨 论

UAER是DKD发生发展的重要指标，在很大程度上预示着DKD的进展，即使是在正常范围内的增高变化(<30 mg/d)也仍然会增加进展至晚期慢性肾脏病的风险[7-8]。本研究模型组大鼠均出现了UAER增加的早期DKD表现，可以用于早期DKD的实验研究。

本研究各糖尿病大鼠的UAER呈进行性增加，出现了DKD的早期表现，复方丹参滴丸干预后，虽然UAER仍有增加，但其增加的程度明显低于DC组，说明复方丹参滴丸具有延缓早期DKD进展的作用。当然，厄贝沙坦延缓UAER进展的作用更为突出。有学者应用复方丹参滴丸对糖尿病大鼠进行预防性干预，得到了相同的改善效果[9]。

从早期DKD大鼠的肾功变化来看，本实验中各组大鼠的肾功能基本稳定，均未出现肾功能不全现象。相比之下，CDDP组大鼠血肌酐水平显著低于NC组，但这并不意味着对肾功能的改善，而提示可能CDDP干预组大鼠出现了肾小球高滤过状态。DKD的早期改变表现为肾小球滤过率增加，肾小球体积增大，呈现高灌注、高滤过、高跨膜压的“三高”状态。本研究DC组大鼠肾小球面积增大，提示了这种高滤过的血流动力学状态；IRS组的肾小球面积与NC组相当，可能是厄贝沙坦的干预改善了早期DKD的高滤过改变。但确切的肾小球三高状态仍需要通过微穿刺下球内压测定进行证实。本研究CDDP组的肾小球面积也有所增大，且血肌酐水平较其他组有所下降，这提示肾小球可能存在高滤过的血流动力学状态，使肌酐、尿素氮等代谢产物的排泄增多。诸多研究提示复方丹参滴丸有改善心血管等微循环的作用，但对DKD微循环血流动力学的改善与肾脏的远期预后的作用还有待进一步研究分析。

对肾小球及肾小管病理变化的比较显示，DC组大鼠的肾小球系膜区面积比例和GBM厚度较正常组显著增加；经复方丹参滴丸及厄贝沙坦干预后的上述指标仍较正常组明显增加，但与DC组大鼠比较，其增加的程度有显著改善；复方丹参滴丸对系膜区面积的改善作用与厄贝沙坦相当，对GBM厚度的改善不及厄贝沙坦。这提示复方丹参滴丸对DKD肾小球细胞外基质沉积有改善作用，可能是其延缓早期DKD进展及降低微量白蛋白尿的病理基础。

肾小管间质胶原沉积同样是DKD的主要病理改变之一，逐步进展为间质纤维化、小管萎缩，最终引起肾功衰竭。本研究中的模型组大鼠胶原纤维沉积比例仅有轻度变化，CDDP组的间质胶原纤维比例与DC组相比有减少趋势，但未见显著改善，IRS组的改善作用显著。

影响细胞损伤以及ECM沉积的因素多而复杂，其中各种细胞因子如生长因子、炎症因子的作用非常重要。VEGF在肾脏中主要由足细胞分泌，改变内皮细胞的通透性调节和维持足细胞的形态和结构[10]。研究表明VEGF 在DKD发生和发展中起着重要作用[11]。从单纯糖尿病、DKD到DKD合并肾衰竭患者的CTGF呈现显著性逐渐升高趋势[12]，说明CTGF水平升高与DKD进展密切相关。MCP-1趋化单核/巨噬细胞在肾组织浸润，与细胞外基质的沉积、肾小球的硬化密切相关[13]。本研究DKD对照组大鼠肾小球内的生长因子VEGF、CTGF及炎症因子MCP-1的表达均显著增高。复方丹参滴丸和厄贝沙坦干预后，虽然以上细胞因子的表达仍较NC组明显增加，但与DKD大鼠相比，两种药物的治疗性干预都显著降低了VEGF、CTGF、MCP-1表达增加的程度。复方丹参滴丸对VEGF的改善作用不及厄贝沙坦，对于CTGF和MCP-1表达的下调作用都很显著，尤其是对MCP-1的表达。有体外实验表明，三七皂苷PNS能够抑制尿毒血清诱导的肾小管上皮细胞增生和总胶原的分泌，还能够抑制TGF-β1和CTGF的表达[14-15]，那么推测在早期DKD中，对肾小球CTGF的下调作用一方面可能来自于三七皂苷。复方丹参滴丸在控制心血管疾病中显示出了良好的抗氧化应激损伤的作用，其中丹参能够使血浆中的脂质过氧化物水平降低，而使超氧化物歧化酶上升，提示丹参是良好的氧自由基清除剂。有研究表明在人肾小球系膜细胞中，糖基化终产物通过其受体激活氧化应激效应诱导MCP-1的表达上调[16]，是DKD发生发展的可能机制。因此，推测复方丹参滴丸对抗氧化应激的作用可能会下调MCP-1表达，进而减轻细胞损伤。本实验结果提示，复方丹参滴丸改善DKD肾脏细胞的形态功能及减少ECM沉积的作用机制，可能与该药对生长因子VEGF、CTGF及炎症因子MCP-1表达的下调有关。而CDDP对细胞因子调节的具体机制还需要体外实验来进一步明确。

总之，复方丹参滴丸能够有效延缓STZ诱导的早期DKD大鼠微量白蛋白尿的发展，并且对DKD肾小球系膜基质增多及肾小球基底膜增厚具有改善作用，这些作用可能与下调生长因子VEGF、CTGF及炎症因子MCP-1有关。

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(编辑 国 荣)

Protective effects of Compound Danshen Dripping Pills on early diabetic kidney disease and its underlying mechanism

LU Wan-hong1, ZHANG Xiao-tian2, CHENG Shao-li2, SHI Bing-yin3

(1. Department of Nephrology, the First Affiliated Hospital; 2. School of Basic Medical Sciences; 3. Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital,Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To explore the effects of Compound Danshen Dripping Pills (CDDP) on early diabetic kidney disease in streptozocin-induced rats of hyperglycemia, and its underlying mechanism. Methods Hyperglycemic rat animal model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin. The model rats were then randomly divided into model group, Compound Danshen Dripping group and irbesartan group. They were then given distilled water, compound Danshen Dripping Pills and irbesartan by intragastric administration, respectively. An additional control group received the same volume of distilled water instead. Urinary albumin, serum creatinine and blood glucose were determined; kidney tissues were observed by PAS and Masson staining; the renal ultrastructures were assessed by electron microscopy. The VEGF, CTGF, and MCP-1 expressions were immunohistochemically detected. Results Compound Danshen Dripping Pills in large doses reduced blood sugar and urinary albumin excretion rate. The renal pathological changes were ameliorated by Compound Danshen Dripping pills. VEGF, CTGF, MCP-1 protein expression levels were decreased. Conclusion Compound Danshen Dripping Pills can effectively reduce renal damage caused by diabetes, which may be related to the decreased expressions of VEGF and inflammatory factors.

Compound Danshen Dripping Pill; diabetic kidney disease; urinary albumin excretion rate; VEGF; CTGF; MCP-1

2014-12-22

2015-09-07

陕西省科技计划项目(No.2007K14-04) Supported by Science-technology Plan of Shaanxi Province (No.2007K14-04)

施秉银. E-mail: shibingy@126.com

R285

A

10.7652/jdyxb201601025

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151208.1747.014.html(2015-12-08)