吕树作,李雪红,王洁琼,张灿军(洛阳农林科学院,河南 洛阳 471023)

小麦小孢子胚胎发生机制及培养技术研究进展

吕树作,李雪红,王洁琼,张灿军
(洛阳农林科学院,河南 洛阳 471023)

小孢子培养技术是获得双单倍体的最佳途径,在育种和基础研究方面均具有很大的应用潜力。从小麦小孢子胚胎发生的形态学、生理生化水平及分子水平等方面阐述小麦小孢子胚胎发生机制,从供体材料基因型、生理状态、取材时期及供试材料预处理、小孢子的分离纯化、诱导培养、再生培养等培养技术方面综述了小孢子培养的主要影响因素,并提出了研究中亟待解决的问题。

小麦; 小孢子培养; 小孢子胚胎发生

双单倍体不仅能应用于育种,加速育种进程,还可用于遗传分析、遗传图谱的构建和分子标记等基础研究,成为多种作物研究的热点。不同作物获得双单倍体的方法不尽相同。目前,小麦获得双单倍体的方法有花药培养[1]、与玉米杂交[2]及游离小孢子培养。与其他培养技术相比,小麦游离小孢子培养技术培养效率高,小孢子分离数量大,短时间内可以获得大量生理一致的小孢子;其次,可观察研究单个小孢子,便于进行细胞学、生理生化及遗传方面的研究。因此,小麦小孢子培养逐渐成为获得小麦双单倍体的首选途径。概述了小麦小孢子胚胎发生机制及其培养技术中影响游离小孢子培养的主要因素,并提出了待解决的相关问题,旨在为小麦游离小孢子培养后续研究提供参考。

1 小麦小孢子胚胎发生机制

1.1 小麦小孢子胚胎发生的形态学研究

小孢子胚胎形成过程可划分为小孢子胚性潜力的获得、孢子壁包裹的多细胞结构的形成、胚状体结构的产生3个阶段。

小孢子胚性的获得是胚胎发生的首要条件,是游离小孢子培养技术中的关键步骤。在正常情况下,小孢子的配子体发育途径是经过不均等的有丝分裂形成1个营养细胞和1个生殖细胞,生殖细胞继续分裂形成2个精细胞[3]。在外界诱导因素作用下,游离小孢子形态和亚细胞器发生变化,如细胞膨大、液泡破裂、细胞核向中央移动、淀粉粒和核糖体减少、细胞质形态改变等,使发育途径由配子体途径向孢子体途径改变[4]。外界诱导因素对小孢子的影响,无论是直接或是间接,都会改变肌动蛋白细胞骨架和微管的结构。由微管和肌动蛋白丝形成的早前期带决定细胞板的形成位置和细胞能否发生均等分裂,连续的早前期带可使小孢子均等分裂,进而发育成胚[5]。Indrianto等[6]将小麦小孢子经33 ℃热激处理后镜检，发现存在3种形态的小孢子，Ⅰ-型小孢子形似单核晚期,具有中央大液泡,细胞核位于萌发孔对面细胞壁边缘的层状细胞质中;Ⅱ-型小孢子液泡被细胞质链分割成几个小液泡,细胞核紧贴小孢子壁;Ⅲ-型小孢子细胞质包裹着位于小孢子中央的细胞核,呈现出星状结构。3种形态小孢子中,Ⅲ-型小孢子大多数能够发育成胚。经诱导处理一段时间后,部分Ⅰ-型和Ⅱ-型小孢子能够发育成Ⅲ-型小孢子,推测这3种形态并不是判断小孢子具有胚胎发生能力的标准,而是处于小孢子不同发育阶段。因此,小麦小孢子胚性诱导过程中,小孢子在显微镜下呈现星状(纤维状)结构被普遍认为是小孢子获得胚性的标志[5,7]。

小孢子获得胚性之后,经诱导培养首先分裂成由孢子壁包裹的多细胞结构。Liu等[8]观察到小麦多细胞结构形成是在诱导培养开始12 h至1周内完成,1周内小孢子体积变化不大。小麦中小孢子细胞的分裂途径主要有A、B、C 3种,3种途径形成的基础在于第1次有丝分裂是否发生均等分裂。A途径是小孢子不均等分裂产生1个营养核和1个生殖核,营养核持续分裂形成多细胞结构;B途径是单核期小孢子发生均等分裂产生2个对称的、类似的细胞核,进而持续分裂形成多细胞结构,是小孢子胚胎发生过程中细胞分裂的主要途径;C途径是营养核或生殖核分裂途径中发生核融合,产生具有二倍体染色体数的愈伤组织或胚胎[6,9-10]。分裂通过A途径或B途径,取决于第一次细胞分裂是否为均等分裂,而C途径在2种情况下均有可能发生。小孢子第1次有丝分裂是否发生均等分裂,与预处理方式有关,在甘露醇预处理中通常观察到均等分裂,而在低温预处理中却常观察到不均等分裂,且胚胎发生诱导率不受分裂途径的影响[9,11]。

获得胚性的小孢子经某一分裂途径不断分裂形成由孢子壁包裹的多细胞结构后继续发育突破花粉壁,继而形成各种类型的胚。

1.2 小麦小孢子胚胎发生的生理生化及分子水平研究

小孢子在一定外界条件下由配子体途径向孢子体途径转变,在胁迫诱导过程中会发生一系列生理生化变化,如淀粉合成受阻、热激蛋白高效表达、脱落酸大量合成及蛋白质合成、磷酸化和糖基化的改变[12]。在该过程中抑制配子体发育途径基因表达、激发孢子体途径基因表达的过程是如何调控的,胚胎发生过程中差异表达基因有哪些,这些问题的探究有助于对胚胎发生机制的研究。用于鉴定小孢子胚胎发生差异表达基因的途径有2条：一是利用体内胚胎发生过程中合成的基因产物作为小孢子胚胎发生的探针;二是对配子发生和小孢子胚胎发生进行基因表达比较研究[13]。Reynolds等[14-16]通过构建cDNA文库分离出2个在胚胎发育初期特异表达的基因,其中一个基因是小麦金属硫蛋白(EcMt)基因,并将该基因的转录表达作为胚胎发生的标志,进一步研究发现,脱落酸(ABA)含量及Ca2+浓度均影响该基因的表达。Sánchez-Díaz等[17]在小麦胚胎发生的各个时期均进行基因检测,检测到细胞抗胁迫保护基因谷胱甘肽S转移酶基因GSTF2和GSTA2、与信号机制有关的TaTPD1-like(tapetum determinant 1-like)和TAA1b基因、阿拉伯半乳糖蛋白基因TaFLA26和TaAGP31-like、新的胚胎特有基因TaEM1等,同时发现Tad1是小麦小孢子胚胎发生特有的基因;有趣的是,前人研究报道中在植物体细胞胚胎发生、玉米和油菜小孢子胚胎发生中均有表达的体细胞胚受体激酶基因(SERKs)在上述研究的小麦易出胚品种中却未表达;对易出胚品种与难出胚品种胚胎发生进行比较发现,难出胚品种小孢子壁破裂前的基因表达提前。

2 小麦游离小孢子胚胎发生的主要影响因素

2.1 供试材料

2.1.1 基因型 供试材料的基因型是决定小麦小孢子培养成功与否的重要因素。Liu等[8]用同种培养方式对8个小麦材料进行小孢子培养,发现不同基因型的出胚率、植株再生率、绿苗比率及自然加倍率均有差异,最易出胚基因型可诱导出6 294个胚,而不易出胚基因型只诱导出68个胚,相差92.5倍,不同基因型的绿苗比率从8%至99%不等,差异悬殊。此外,小麦的冬春性对胚胎发生频率也有影响,一般认为春小麦的出胚率高于冬小麦[18-19]。由于胚胎发生能力可以稳定遗传[8],除通过培养技术改良外,可将不易出胚的小麦品种(系)与易成胚的品种(系)杂交克服某些品种(系)不易诱导出胚的缺点,提高小麦小孢子离体培养效率。

2.1.2 生理状态和取材时期 供体植株长势及病虫害情况等也是小麦小孢子培养成功与否的重要因素。从健壮无病虫害的小麦植株上取得的小孢子活力强、污染概率低,是小麦小孢子培养供体材料的最佳选择。适宜的光温控制、合理的水肥管理及严格的病虫害防治是培育理想小麦植株的关键。由于供试材料的田间露地栽培状况由其生长环境和管理水平共同决定,非人为控制因素过多,因此大多数研究在温室或光照培养箱等环境可控设施中栽培供体植株[7-8]。

不同作物小孢子培养的最佳取材时期有差异,研究发现,小麦小孢子处于单核中晚期时胚胎发生概率最高[9]。由于该发育时期较短,同一穗上小孢子的发育也不同步,应尽量选取大部分小孢子处在单核中晚期的麦穗。不同基因型小麦材料处于该时期的形态可能会稍有差异,常用的方法是取穗子中部花用醋酸洋红[8]或DAPI染色法[17]在显微镜下镜检鉴定。

2.2 培养技术

2.2.1 供试材料的预处理 预处理方式、处理时间、处理液浓度等因素不但与小孢子的分裂途径、小孢子胚胎发生概率相关,对植株再生过程中绿苗产生率、染色体自然加倍率等也有影响[20]。目前,已报道的小麦小孢子培养的供试材料预处理方式有：饥饿处理、4 ℃低温胁迫、33 ℃高温胁迫和化学物质处理等,其中可用于小麦小孢子培养的预处理化学物质较多,如甘露醇、秋水仙素、ABA、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2-萘甲酸(2-HNA)等[5,7,8,21-24]。甘露醇预处理的机制主要是其对小孢子内源激素水平产生影响,一般其单独使用浓度为0.3 mol/L或0.4 mol/L,或配合其他预处理方式使用;秋水仙素不仅能够诱导合成胁迫蛋白,使小孢子内发生适应逆境的生理生化变化,增强小孢子对逆境的抵抗力,还能增加再生植株自然加倍率[23];6-BA不仅能够增加活性小孢子数量还能缩短高温预处理时间、减轻高温伤害[24];2-HNA能够增加诱导时期活性小孢子数量[5]。基于各预处理方式作用机制的差异,预处理技术的改良多采用饥饿处理、温度胁迫处理与化学物质处理结合的方式。

此外,预处理对象对星状结构出现时间、活性小孢子数量、出胚率等也有影响。王春霞等[25]对小麦花药和幼穗分别进行低温预处理,发现将花药处理3 d和将幼穗处理7 d时预处理效果更好,说明处于裸露饥饿状态的小麦小孢子比由旗叶或护颖包裹着的小孢子对环境更敏感。高增玉等[26]对小麦分蘖、穗子、花药及小孢子分别进行高温预处理,发现直接处理小孢子和花药比处理穗子和分蘖时星状结构出现得早、星状结构比率高,但小孢子越裸露活性小孢子数量越少,最终的结果是预处理穗子出胚数量最多,效果最好。

预处理为小孢子提供不利于正常发育的环境,胁迫小孢子胚胎发生,这种不利环境不但改变小孢子发育途径,同时也增加了诱导阶段乙烯、活性氧及NO等有害物质的含量,导致细胞死亡。降低预处理中胁迫处理带来的损伤,是解决细胞早期死亡的关键。Mehran等[18]比较有无预处理胁迫2种方法处理小麦小孢子：(1)利用饥饿胁迫与33 ℃高温胁迫预处理小麦花药4 d后,再进行提取、分离纯化及A2培养基(含新鲜子房)诱导培养;(2)取新鲜麦穗直接提取、分离纯化的新鲜小孢子，直接加入A2培养基中暗培养4 d,再加入1.0 mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.2 mg/L KT(激动素)和新鲜子房,发现后者植株再生率和绿苗数均增加。Sinha等[27]利用二甲基酪氨酸结合多肽处理小麦和黑小麦小孢子,可以阻止小孢子氧化损伤和死亡,增加小孢子绿色植株再生率。

2.2.2 小麦小孢子的分离和纯化 小麦小孢子分离方法主要有6种：自然脱落法、涡流振荡法、超声法、磁力搅拌法、研磨法、微型搅拌器搅拌法。Hu等[21]采用涡流振荡法、超声法、磁力搅拌法和研磨法4种方法均分离出大量小麦小孢子,涡流振荡法分离出有活力的小孢子数最多,分离效果最佳;研磨法获得的小孢子数最多,但有活力的小孢子数量最少,分离效果最差。Gustafson等[28]比较微型搅拌器搅拌法、磁力搅拌法、离析法及自然脱落法对小孢子的分离效果,发现微型搅拌器搅拌法分离的小孢子存活率最高,可达75%,与其他分离方法相比,该法还具有操作简单、分离速度快、分离数量大等优点,被广泛应用于小麦小孢子的分离[7,8,21]。

通常,分离出的小孢子中含有死亡小孢子、无胚胎发育能力小孢子、细胞碎片、花药壁破碎物质等杂质,可能会释放酚类等有害物质,改变诱导培养基pH值或渗透压,从而影响小孢子培养效率。为了达到最好的培养效果,小孢子的纯化步骤必不可少。小麦小孢子纯化方法主要有2种,不同孔径筛网过滤法和密度梯度离心法。不同孔径筛网过滤法：根据预处理后具有胚性的小麦小孢子体积增大至约60 μm[26],可经90～100 μm筛网或与38～40 μm筛网双重过滤的方法将花药壁破碎物等大的杂质及无活力、死亡小孢子或细胞碎片等小的杂质过滤出来[5,21]。该法成本小、简单易行,但纯化效果较差。密度梯度离心法：在过滤的基础上进行密度梯度离心是小麦游离小孢子纯化的最常用方式。根据获得胚性的小孢子中液泡浓度与其他杂质不同的特性,可利用Percoll密度梯度离心[7]将其分离出来。由于Percoll试剂价格昂贵,实际生产中大量应用的成本较高,需要一个经济有效的方法来替代,因此后来多采用21%麦芽糖来替代Percoll[5,24-25]。

2.2.3 小麦小孢子的诱导培养

2.2.3.1 诱导培养基 小孢子获得胚性后,为其提供最佳诱导环境至关重要。首先是基本培养基组成成分的选择,目前已报道的常用于小麦游离小孢子培养的培养基有A2[7]、MMS3[20]、MMS4[29-30]、CHB-2[31]、NPB99[5],这些培养基大多都是在MS、N6或B5培养基的基础上改进的[19]。Hamid等[32]将NPB99、C17、W14、CHB-2和P2作为诱导培养基,发现NPB99、C17和W14的小麦单穗胚胎诱导数较高,但CHB-2的植株再生率及绿苗比率均最高。

培养基渗透压对出胚率、植株再生能力及绿苗比率也有影响。Liu等[8]用介于150～500 mOsmol/kg的8个渗透压处理诱导胚,发现渗透压为300 mOsmol/kg时诱导的胚最多;Muhammad等[33]采用介于350～500 mOsmol/kg 的4个渗透压处理诱导胚,发现渗透压为350 mOsmol/kg时小麦的出胚率和绿苗比率最大。上述2个研究结果存在差异可能与供体基因型、操作方法或诱导环境不同有关。

在培养基中添加糖不仅能为小孢子培养提供碳源,对渗透压的维持也起重要作用。其他作物小孢子培养多采用蔗糖作为培养基的碳源[34],但在小麦小孢子培养中麦芽糖被公认为唯一的碳源[35]。李光威等[36]以蔗糖、葡萄糖以及葡萄糖加果糖代替麦芽糖进行小孢子诱导培养,均没有胚状体出现。产生这种现象的原因可能是小麦游离小孢子对环境的敏感性比其他作物高,蔗糖、葡萄糖及果糖对其产生的毒害作用大。

2.2.3.2 外源激素及其他添加物 培养基中外源激素的类型和浓度影响胚的数量及质量。预处理方式、基本培养基、供试材料基因型及诱导环境差异,可能导致小麦小孢子对外源激素的需求不同,最佳外源激素类型及浓度尚无统一结论。处于游离状态的小孢子直接接触培养基时,对培养基较敏感,外源激素浓度要求一般低于花药培养。除常用的生长素6-BA、2,4-D、KT、苯乙酸(PAA)外,新型外源激素也逐渐在小麦诱导培养基中使用,α-植物磺肽素(PSK-α)是近年来发现的一种新型植物肽类生长调节物质,可促进细胞的生长和增殖,在小麦小孢子诱导培养基中添加10-7mol/L PSK-α可以增加胚状体和绿色再生植株数量[37]。

在诱导培养基中添加氨基酸、抗氧化剂及抗生素等物质也能提高小麦小孢子诱导效率。Muhammad等[38]将多种线粒体和质体抗氧化剂分别加入小麦诱导培养基中,发现添加线粒体抗氧化剂脯氨酸或质体抗氧化剂谷胱甘肽均能提高胚状体数和绿苗数,添加水杨酸则能降低白化苗的产生。由于供试材料自带、麦穗表面消毒不彻底或人为操作不当等原因可能会造成培养基污染,除改进消毒方式、改善操作技能等方式外,在小麦诱导培养基中加入抗生素也能降低污染率,在诱导培养基加入100 mg/L头孢噻肟不但可以降低污染率,还可提高出胚率及再生植株数[39]。

2.2.3.3 子房共培养 在小麦诱导培养基中加入未成熟的小麦子房与小孢子共培养,可以显著提高胚状体的质量,增加胚状体诱导率和植株再生能力[20,40]。Liu等[8]发现,在小麦诱导培养基中加入研磨的未成熟小麦子房对小孢子胚性诱导无影响,推测并非子房成分而是活的子房释放的某种“护理因子”诱导胚状体产生;同时发现,子房基因型对小孢子胚性诱导的影响不大,甚至可以用燕麦、大麦子房代替小麦子房。在辣椒小孢子诱导培养试验中也得出同样的结论,Lantos等[41]利用小麦或辣椒子房共培养方式诱导辣椒胚状体,发现小麦子房共培养能够产生胚状体,诱导效果甚至优于辣椒子房共培养。用子房预处理培养基(OVCM)代替子房共培养诱导小孢子,也能诱导出大量的胚[22,42],Zheng等[42]对OVCM和子房共培养2种诱导方式进行比较发现,OVCM诱导的出胚早,胚状体长势整齐一致,而子房共培养培养基上诱导的胚状体较前者多,但是生长不同步,诱导培养28 d后还不断有新的胚状体产生。产生这种现象的原因是,OVCM在子房预处理阶段积累大量“护理因子”,子房取出后“护理因子”不再增加,在小孢子诱导早期就可以快速一致地发挥作用;而子房共培养培养基是在诱导开始后释放“护理因子”的,早期浓度较低,但持续时间长,贯穿整个诱导时期,产生显著多于OVCM培养的胚。对该“护理因子”,目前还没有定论,可能含有PAA或其类似物及某些氨基酸等营养物质[20,36],也可能含有阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)[29],或是多种物质的混合物,需进一步研究验证。

2.2.3.4 小孢子浓度 小孢子的培养浓度必须适宜,小孢子浓度过低,单位体积诱导培养基产生的胚状体数少,造成资源和人力的浪费。小孢子浓度过高,营养物质供给不足,尤其是在纯化不彻底的情况下,杂质及代谢产物对小孢子的毒害作用加强,致使胚状体数量和质量严重下降。分离纯化后的小麦小孢子需要用血球计数板计数,将小孢子稀释为0.7×104～2×105个/ mL。

2.2.4 小麦胚的再生培养

2.2.4.1 再生培养基 小麦胚在诱导培养基上长至约2.0 mm时,即可转移到再生培养基上进行培养。胚的质量关系到植株的再生率。王春霞等[25]发现,诱导培养28～29 d、直径达2.0 mm的小麦胚均可分化成苗,且绿苗比率较高;培养32～38 d、直径为2.0 mm的胚再生率虽高,却几乎全为白化苗;而培养43～48 d、直径为2.0 mm的胚基本不能进一步分化成苗。常用于小麦胚胎再生的培养基主要有190-2[5,8]、A2R[7,43]、MMS5[44]等。相对于其他培养阶段,再生培养操作简单、成功率较高。Meenakshi等[45]用5种不同再生培养基培养小麦胚,发现不同培养基胚再生率差异很大,其中在MMS5中加入5 mg/L维生素C培养效果最好,优于在MMS5培养基上添加激素和MS、190-2培养基。由此可见,通过系统地改良再生培养基,也可提高绿色植株再生率。

2.2.4.2 白化现象 白化现象在小麦等谷类作物双单倍体培养中普遍存在,小麦小孢子培养中白化苗的比率高达50%以上,甚至接近100%[8,18,43]。产生这种现象的原因是预处理阶段质体发生变化,不能够转化为叶绿体。通过改进预处理方式等,可以减少白化苗的产生。Liu等[46]发现,对于易产生白化苗的小麦基因型,在预处理培养基中加入10%NPB98可以提高绿苗产生率,而对绿苗率高的基因型也无副作用。预处理温度对白化苗的影响也较大,高温预处理常常产生高比例的白化苗;而低温预处理则可促进绿苗产生,但因胚诱导率极大降低,故绿苗总数下降[36,46],在高温预处理时降低高温损伤或在低温预处理的基础上结合其他处理提升胚诱导率,或许是减少白化苗、提升绿色植株再生率的有效方法。

2.2.4.3 再生植株自然加倍率 再生植株的自然加倍率与基因型和培养条件均有密切关系。小麦不同基因型自然加倍率差异较大,从20%到80%不等[5,8];秋水仙素通过抑制有丝分裂过程中纺锤体的形成阻止姊妹染色单体的分离使染色体数目加倍,对于自然加倍率较低的小麦基因型,添加秋水仙素可以提高再生植株自然加倍率。在小麦小孢子诱导初期添加秋水仙素可提高再生植株自然加倍率,而在甘露醇预处理阶段添加,加倍率则没有明显提升[22,47]。

3 展望

继1993年,Mejza等[35]和Tuvesson等[48]利用小麦小孢子成功获得再生植株后,经过20多年的研究和技术改进,游离小孢子培养技术在小麦中已取得长足的进步,并逐渐成为小麦获得双单倍体的首选途径,但仍有许多问题有待进一步研究和解决。首先,外界条件诱导小孢子胚胎发生虽已被公认,但是由于可诱导胚胎发生的外界条件差别较大,诱导后小孢子生理生化指标、基因表达及细胞结构的改变也不尽相同,胚胎发生的途径也不是单一的,这无疑给胚胎发生机制的研究增加了难度;不同外界条件下的诱导机制存在怎样的差异,小孢子受怎样的调控如何改变配子体向孢子体发育途径的,依旧不清楚。其次,供试材料基因型对小孢子培养的影响已是公认的,但差异是由哪些基因控制,其细胞结构、生理生化指标及基因表达是否有差异,培养技术改良是否要依据基因型差异而改变等方面需要进一步研究。另外,培养技术改良是提高培养效率的关键,很多在前期报道中难以出胚的品种在技术改良之后都可以获得再生植株[5]。由于供试材料基因型、试验设计、操作环境及操作技术手段等方面的差异造成的培养结果重复性差、结论难统一等问题依旧存在;胚诱导率低、植株再生率低以及白化现象也未能完善解决,仍有许多性状优良的小麦基因型植株再生率低,甚至有些基因型无法再生绿色植株,阻碍其在生产上的应用;而且,我国对小麦离体小孢子培养的报道较少,大多停留在培养体系建立及初步应用研究上,相关技术也仅掌握在部分研究者手中,对我国小麦主要基因型的胚胎发生能力也不很清楚。随着技术的发展和完善,胚胎发生机制将更明确,培养技术将更加完善,小孢子培养技术在育种和基础研究上的巨大潜在优势将被充分挖掘。

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Research Progress on Microspore Embryogenesis Mechanism and Culture Techniques in Wheat

LÜ Shuzuo,LI Xuehong,WANG Jieqiong,ZHANG Canjun
(Luoyang Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Luoyang 471023,China)

Microspores culture is the best technology to obtain double haploids and has great potential for breeding and fundamental research.The wheat microspore embryogenesis mechanism was expounded at morphological,physiological and biochemical,molecular level.Meanwhile,the main factors of wheat microspore culture were summarized from the aspects of genotype,physical conditions,sampling time of donor plants,and main culture techniques such as pretreatments of donor plants,isolation and purification,induction culture and regeneration culture.Finally,the problems needed to be solved were pointed out.

wheat; microspore culture; microspore embryogenesis

2016-03-26

河南省科技创新人才计划项目(134200510003)

吕树作(1978-)，男，河南新安人，助理研究员，博士，主要从事农业生物技术研究。E-mail：lvshuzuo@163.com

S512.1

A

1004-3268(2016)09-0008-07