曹剑锋,芦静波,滕树学,任朝辉,陈慧琴(.贵州师范学院,贵州 贵阳 55008； .皖南医学院,安徽 芜湖 00； .贵阳市乌当区人民医院,贵州 贵阳 55008； .贵州师范大学,贵州 贵阳 55000)

密蒙花总黄酮的抗氧化及免疫调节作用

曹剑锋1,芦静波2,滕树学3,任朝辉4,陈慧琴1
(1.贵州师范学院,贵州 贵阳 550018； 2.皖南医学院,安徽 芜湖 241002； 3.贵阳市乌当区人民医院,贵州 贵阳 550018； 4.贵州师范大学,贵州 贵阳 550001)

为研究密蒙花总黄酮(TFB)对D-半乳糖所致衰老小鼠的抗氧化和免疫调节作用,以200 mg/(kg·d)的剂量对昆明雄性小鼠皮下注射D-半乳糖建立衰老模型小鼠，对模型小鼠分别灌胃TFB 25、50、100 mg/(kg·d)或维生素E 50 mg/(kg·d)，正常对照组及模型对照组灌服等剂量的蒸馏水，连续灌胃40 d，取血清测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶 (LDH)及总胆红素(TBIL) 和总蛋白(TP)含量，取肝脏与脾脏计算脏器指数并测定肝及脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力及谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量，并做组织切片观察肝脏组织病理学变化。结果表明，与模型对照组比较，50、100 mg/(kg·d)剂量的TFB 能显著抑制衰老小鼠血清AST、AST、ALP、LDH活力和TBIL含量的升高；并且能使小鼠肝和脑组织中的SOD活力和GSH含量显著升高,使MDA含量降低。其中,50 mg/(kg·d)剂量组使肝和脑组织中SOD活力分别显著升高10.49%和26.16%，使GSH含量分别显著升高42.10%和31.64%，使MDA含量分别显著降低55.03%和20.86%。各剂量组TFB均能明显提高衰老小鼠的脾脏指数和胸腺指数，50 mg/(kg·d) TFB剂量组使胸腺指数显著升高23.08%。肝组织切片病理学检查显示，TFB各剂量均可以减轻肝脏组织病理性改变。综上，TFB对 D-半乳糖损伤模型小鼠的损伤具有改善作用。

密蒙花； 总黄酮； 抗氧化； 免疫调节

密蒙花(BuddlejaofficinalisMaxim)为常用中药，为马钱科醉鱼草属植物[1]。密蒙花的传统功效为清热养肝、明目退翳，治疗目赤翳障等疾病。现代药理作用研究表明，其具有多种药理活性，主要表现在抗炎、免疫调节、抗氧化、降血糖、治疗干眼症等眼部疾病和抗肿瘤等作用[2]。密蒙花总黄酮(TFB)是一种天然药物，其临床应用有较高的安全性，具有良好的应用前景[3]。研究表明，TFB具有良好的抗氧化、清除自由基的活性[4]。

基于TFB良好的抗自由基活性，为进一步探索TFB作为天然药物的免疫调节和抗氧化保护作用，本研究建立了D-半乳糖亚急性衰老模型，测定了小鼠免疫器官指数、血液生化指标，肝、脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH) 含量以及肝组织的病理变化，研究TFB对D-半乳糖所致衰老小鼠的抗氧化和免疫调节作用，以期为将TFB开发成新的安全、有效的免疫增强剂或天然抗氧化剂提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

密蒙花干药材购自贵阳市药材市场，D-半乳糖、芦丁购自国药集团化学试剂有限公司。

谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TIBL) 检测试剂盒购自北京利德曼生化股份有限公司；总蛋白(TP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽 (GSH )检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；曙红Y购自国药集团化学试剂有限公司；中性树胶购自中国上海懿洋仪器有限公司。

1.2 仪器设备

冷冻离心机购自德国艾本德股份公司；722型可见分光光度计购自上海光谱仪器有限公司；旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂；真空冷冻干燥系统购自河南兄弟仪器有限公司；干燥箱购自天津市泰斯特仪器有限公司;自动生化分析仪AU680购自美国贝克曼公司。

1.3 TFB的提取及含量测定

参照熊勇等[6]提取黄酮的方法提取TFB，测定其含量，TFB提取物冷冻干燥后于中4 ℃条件下保存备用。

精确称取经干燥至恒定质量的芦丁对照品20.0 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL，配成200 μg/mL芦丁对照品溶液，准确吸取对照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL移入10 mL试管中，用甲醇定容至5 mL，各加0.05 g/mL NaNO2溶液0.3 mL，振摇后放置5 min，加入0.10 g/mL Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，加1.0 mol/L NaOH溶液2 mL，用甲醇定容至10 mL，静置10 min，以零管为空白，摇匀后在510 nm波长处测定吸光度(A510)，以A510为纵坐标，以芦丁的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。准确称取纯化后的密蒙花浸膏1.0 g，加甲醇溶解并定容至500 mL，按照标准曲线绘制方法测定吸光度，并根据芦丁标准曲线计算总黄酮含量。

1.4 小鼠D-半乳糖衰老模型的建立

供试健康昆明小白鼠由贵州医科大学实验动物中心提供 [许可证号： SCXK(黔)2012-0001]，室温条件下常规饲养。选取60只体质量(20±2)g的昆明雄性小鼠，随机分为6组，分别为正常对照组、模型对照组、维生素E组及TFB低、中、高剂量组。除正常对照组外，其余各组以200 mg/(kg·d)的剂量皮下注射D-半乳糖建立衰老模型，正常对照组注射等剂量的生理盐水，连续30 d造成衰老模型。TFB低、中、高剂量组分别灌胃给予TFB 25、50、100 mg/(kg·d)，维生素E组灌服维生素E50 mg/(kg·d)、正常对照组及模型对照组灌服等剂量的蒸馏水，连续灌胃40 d，每天灌胃1 次，第41天，摘小鼠眼球取血，分离血清，同时分离肝脏、肾脏、胸腺及脾脏，置于冷的生理盐水中，剔除脏器表面脂肪组织，精确称质量并记录。另外剪下肝右叶，置于体积分数10%甲醛中固定，待做病理检测。计算脏器指数，脏器指数=(脏器质量量/小鼠体质量)×100%。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 血清ALT、AST、ALP、LDH 活力以及TIBL、TP含量 按照试剂盒说明书测定分离血清中ALT、AST、ALP、LDH 活力以及TIBL、TP含量。

1.5.2 肝脏、脑组织SOD活力及GSH、MDA含量 取小鼠肝脏及脑组织准确称质量，在预冷的生理盐水中冰浴匀浆，制成质量分数10%的组织匀浆液，于4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液于-20 ℃条件下保存备用。按照试剂盒说明书测定肝脏、脑组织SOD活力及GSH、MDA含量。

1.5.3 肝脏组织形态学 取小鼠肝右叶组织置于体积分数10%的中性甲醛溶液中固定，常规脱水、石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察肝组织的形态学变化。

1.6 数据统计分析

数据采用SPSS 11.5软件进行数据分析与处理，以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 TFB中黄酮含量测定结果

以芦丁为标准品绘制标准曲线,并根据芦丁标准曲线计算密蒙花提取物黄酮含量为70.6%。

2.2 TFB对D-半乳糖诱导衰老小鼠脏器指数的影响

从表1可以看出，与正常对照组相比，模型对照组小鼠胸腺指数和脾脏指数明显分别显著低于正常对照组35.00%、35.29%。与模型对照组比较，维生素E和TFB中剂量组胸腺指数分别显著升高38.46%和23.08%，维生素E组及TFB高、中剂量组脾脏指数分别升高27.28%(P<0.05)、9.09%(P>0.05) 、4.55%(P>0.05)，各组间肝脏和肾脏指数均升高，但差异均不显著。

表1 TFB对D-半乳糖诱导衰老小鼠脏器指数的影响 (n=10)

组别剂量/[mg/(kg·d)]肝脏肾脏脾脏胸腺模型对照组3．98±0．211．36±0．070．22±0．050．13±0．01正常对照组5．03±0．69∗1．52±0．08∗0．34±0．05∗∗0．20±0．04∗∗TFB剂量组254．07±0．411．39±0．070．21±0．020．14±0．02504．27±0．321．44±0．020．23±0．020．16±0．02∗1004．49±0．311．48±0．120．24±0．020．15±0．08维生素E组504．62±0．421．39±0．050．28±0．04∗0．18±0．01∗

注：与模型对照组比较，*表示差异显著(P<0.05),**表示极显著(P<0.01 )，下同。

2.3 TFB对D-半乳糖诱导衰老小鼠血清中ALP、AST、ALT、LDH活力和TIBL、TP含量的影响

由表2和表3可知，与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清中的ALP、ALT、AST、LDH 活力和TIBL含量分别显著升高84.80%、59.68%、49.79%、153.70%和175.71%，TP含量降低23.59%。与模型对照组比较，TFB中、高剂量组和维生素E组小鼠血清中ALP活力分别显著降低44.09%、31.80%和42.19%，ALT活力分别降低8.63%(P>0.05)、9.91%(P<0.05)和14.68%(P<0.05)，AST活力分别显著降低21.89%、 23.49%和30.11%，LDH活力分别显著降低33.27%、32.77%和55.69%，TIBL含量分别降低46.21%(P<0.05)、24.87%(P>0.05)和52.33%(P<0.05)，TP含量分别显著升高19.93%、20.12%和16.46%。

表2 TFB对D-半乳糖诱导衰老小鼠血清酶活力的影响 (n=10)

组别剂量/[mg/(kg·d)]ALT/(U/L)AST/(U/L)ALP/(U/L)LDH/(U/L)模型对照组38．34±5．68128．43±19．2085．53±11．262850．76±537．02正常对照组24．01±6．08∗85．74±16．65∗46．28±5．61∗∗1123．67±268．14∗∗TFB剂量组2535．52±1．73116．53±11．3770．67±8．732428．50±308．585035．03±4．00100．32±8．32∗47．82±10．53∗∗1895．33±153．26∗10034．54±5．39∗98．26±16．56∗58．33±11．84∗1916．59±195．64∗维生素E组5032．71±3．21∗89．76±11．17∗49．52±8．58∗∗1263．28±293．21∗∗

表3 TFB对D-半乳糖诱导衰老小鼠血清TIBL和TP含量的影响(n=10)

组别剂量/[mg/(kg·d)]TIBL/(μmol/L)TP/(g/L)模型对照组1．93±0．3746．72±5．01正常对照组0．70±0．17∗61．14±3．61∗TFB剂量组251．73±0．2152．86±2．65501．32±0．29∗56．03±0．95∗1001．45±0．3856．12±7．11∗维生素E组500．95±0．53∗55．41±2．45∗

2.4 TFB对D-半乳糖诱导衰老小鼠肝组织中SOD活力和GSH、MDA含量的影响

由表4可以看出，与正常对照组对比，模型对照组小鼠肝组织中的SOD活力和GSH含量分别显著降低14.27%和33.61%，而MDA含量显著升高209.73%。与模型对照组相比， TFB中、高剂量组和维生素E组小鼠肝组织中的SOD活力升高10.50%(P<0.05)、7.36%(P>0.05)和11.84%(P<0.05)， GSH含量分别显著升高 42.10%、 36.90%和34.82%，MDA含量分别显著降低55.03%、55.40%和65.58%。

表4 TFB对D-半乳糖诱导衰老小鼠肝组织SOD活力和GSH、MDA含量的影响(n=10)

组别剂量/[mg/(kg·d)]SOD活力/(U/mg)GSH含量/(mg/g)MDA含量/(nmol/mg)模型对照组211．17±4．7218．67±0．777．96±0．43正常对照组246．33±7．59∗28．12±3．02∗∗2．57±0．22∗∗TFB剂量组25215．43±9．8821．14±1．834．23±0．50∗50233．34±25．19∗26．53±2．56∗∗3．58±0．44∗100226．72±15．5025．56±3．99∗3．55±0．33∗∗维生素E组50236．17±25．19∗25．17±2．32∗∗2．74±0．10∗∗

2.5 TFB对D-半乳糖诱导衰老小鼠脑组织中SOD活力和GSH、MDA含量的影响

从表5可以看出，与正常对照组对比，模型对照组小鼠脑组织中的SOD活力和GSH含量分别显著降低25.19%和32.16%，而MDA含量显著升高59.44%。与模型对照组相比，TFB中、高剂量组和维生素E 组小鼠脑组织中的SOD活力分别显著升高26.16%、24.65%和28.61%，小鼠脑组织中GSH含量分别显著升高31.64%、22.62% 和42.24%，MDA含量分别显著降低20.86%、17.36%和28.01%。

表5 TFB对D-半乳糖诱导衰老小鼠脑组织中SOD活力和GSH、MDA含量的影响 (n=10)

组别剂量/[mg/(kg·d)]SOD活力/(U/mg)GSH含量/(mg/g)MDA含量/(nmol/mg)模型对照组182．44±7．7111．98±0．2214．86±0．77正常对照组243．86±20．07∗∗17．66±0．60∗∗9．32±0．32∗∗TFB剂量组25204．87±12．0113．26±1．4013．34±1．2350230．16±20．78∗15．77±0．70∗11．76±1．40∗100227．42±24．28∗14．69±0．82∗12．28±0．64∗维生素E组50234．63±5．04∗17．04±0．92∗∗10．69±0．78∗∗

2.6 TFB对D-半乳糖诱导衰老小鼠的肝组织病理形态学的影响

如图1所示，正常对照组小鼠肝脏的肝小叶结构正常，肝细胞索中央静脉为中心，肝细胞无变性、坏死等损伤性改变(图1A)；模型对照组小鼠肝小叶结构紊乱，中央区肝细胞出现严重的水肿样变性或脂肪变性，伴随炎症细胞浸润，肝细胞脂肪沉积和纤维化甚至坏死，形成空泡(图1B)；维生素E组小鼠肝小叶结构基本正常，但肝小叶中央区肝细胞排列紊乱，可见肝细胞水肿样变性或脂肪变性(图1C)；与模型对照组比较，TFB各剂量组均可明显改善小鼠肝小叶结构，不同程度地减少D-半乳糖诱导小鼠肝损伤中肝细胞的水肿和坏死等(图1D—F)，其中TFB中剂量组效果最佳。

A.对照组; B.模型组; C.维生素E组; D—F 分别为TFB高、中、低剂量组图1 TFB处理D-半乳糖诱导的衰老小鼠肝组织病理切片的光镜观察结果(HE，×40)

3 结论与讨论

本研究连续30 d 给小鼠皮下注射D-半乳糖建立亚急性小鼠衰老模型，由试验结果可知，模型对照组小鼠血清中各种标记酶AST、ALT、ALP、LDH活力和TIBL含量明显升高；小鼠肝脏及脑组织中SOD活力和GSH含量明显降低，MDA含量明显增加；行为上可见小鼠行动迟缓，毛色松散无光泽，表明模型建立成功[7-8]。

在一定时间内连续给小鼠注射大剂量D-半乳糖后，会使体内的SOD活性降低和GSH含量降低等，从而使机体的抗氧化水平降低，生物膜脂质过氧化，其中脑受损出现的最早[9]。研究表明，氧自由基造成神经元坏死从而导致一系列的神经性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病[10]。而抗氧化剂能通过缓解氧化损伤，提高脑部抗氧化防御体系[11]。经过中、高剂量TFB的灌胃处理，小鼠脑组织中的SOD活力和GSH含量都明显提高，而MDA含量明显降低，表明中、高剂量TFB可以起到显著抑制脑组织脂质过氧化的作用。

肝脏是机体最主要的排毒器官，具有较高的代谢率，自由基的累积会造成肝损伤，肝脏抗氧化防御体系的完整性对健康非常重要[12]。经过中、高剂量TFB的灌胃处理，可明显降低D-半乳糖所致衰老小鼠肝损伤标记酶AST、ALT、ALP、LDH活性和TIBL含量；小鼠肝组织中的SOD活力和GSH含量都明显提高，而MDA含量明显降低，表明中、高剂量TFB可以起到显著抑制肝脏组织脂质过氧化的作用。对D-半乳糖致衰老小鼠的肝组织病理形态学研究显示，与模型对照组比较，TFB各剂量组可不同程度改善小鼠肝小叶结构，减少肝细胞的纤维化、水肿和坏死等。可见，TFB 具有明显减缓D-半乳糖所致衰老小鼠氧自由基应激损伤，降低脂质过氧化水平，提高机体的SOD活性的作用，提示TFB可有效抑制机体过氧化造成的损伤，是一种良好的抵抗机体氧化应激损伤的抗氧化活性物质。这可能与TFB中含有芹菜素、木樨草素、槲皮素以及藏红花苷等具有显著的抗氧化、抗炎作用活性成分有关[2]。

胸腺是免疫调节的中枢器官，主要用于为T淋巴细胞的分化、成熟提供场所，对于机体的细胞免疫功能以及免疫反应的发生具有重要作用。脾脏是最大的外周免疫器官，其为各种成熟的淋巴细胞提供定居场所以及发生免疫应答场所。随着机体的增龄化进程推进，胸腺和脾脏均会质量变轻，功能下降[13]。胸腺指数和脾脏指数可反映机体非特异性免疫水平[14]，它们的发育状况直接影响到机体免疫力的高低。研究表明，黄酮类化合物具有抗自由基、抗肿瘤、保肝护肝、抗衰老、提高机体的非特异性免疫等作用[15-17]。黄酮类是通过刺激机体免疫器官提高机体的非特异性免疫，从而提高机体的抗病力。本试验结果表明，D-半乳糖所致衰老小鼠胸腺和脾脏指数显著低于正常对照组，中剂量的TFB与维生素E相似，均具有提高衰老小鼠脏器指数的作用，提示TFB可能通过对免疫器官的调控作用来调节免疫功能。综上，本研究中TFB能有效抑制衰老小鼠衰老过程中过氧化造成的损伤，为进一步研究TFB的药理作用及药用价植，促进其开发应用提供了理论依据。

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Immune Regulation Function and Antioxidant Capacities of Total Flavonoids fromBuddlejaofficinalisMaxim DC.

CAO Jianfeng1,LU Jingbo2,TENG Shuxue3,REN Chaohui4,CHEN Huiqin1
(1.Guizhou Education University,Guiyang 550018,China; 2.Wannan Medical College,Wuhu 241002,China; 3.Guiyang Wudang District People’s Hospital,Guiyang 550018,China; 4.Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China)

To investigate the regulatory effects of total flavonoids fromBuddlejaofficinalisMaxim DC.(TFB) on the immune function and antioxidant mechanism in aged mice induced by D-galactose,mice were subcutaneously injected with D-galactose at a dosage of 200 mg/kg body weight once daily to make aged model.Experiment groups were fed with TFB at the dose of 25,50,100 mg/(kg·d) and vitamin E 50 mg/(kg·d) by gavage,respectively; the normal control group and the model control group were fed with the same amount of distilled water once daily,and the experiment lasted 40 days.The activities of alkaline phosphatase(ALP),glutamate pyruvate transaminase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),lactate dehydrogenase(LDH),total bilirubin(TIBL) and total protein(TP) level in serum,and the levels of malondialdehyde(MDA),glutathione(GSH) and the activities of superoxide dismutase(SOD)in the liver and brain tissue were assayed using standard procedures.Immune function in aged mice were used to detect the thymus gland index and spleen index.Meanwhile hepatic histopathological examination was observed.The results showed that TFB at 50,100 mg/(kg·d) investigated doses significantly lowered the levels of serum ALT，AST，ALP，LDH，TIBL,enhanced the activities of SOD,increased the level of GSH,and lowered the levels of MDA of liver and brain.Especially,TFB at 50 mg/(kg·d) investigated doses significantly enhanced the activities of SOD by 10.49% and 26.16%,increased the level of GSH by 42.10% and 31.64%,lowered the level of MDA by 55.03% and 20.86% in liver and brain,respectively.The thymus gland index and spleen index were all higher in the TFB dose groups,TFB 50 mg/(kg·d) increased the thymus gland index by 23.08%.Meanwhile,ameliorating the liver damage were observed in the TFB groups in mice.Thus,TFB was able to enhance the immune function and improve the antioxidant capacities in aged mice induced by D-galactose.

BuddlejaofficinalisMaxim; total flavonoid; antioxidation; immune regulation

2016-04-22

贵州省科技厅自然科学基金项目(黔科合J字[2013]2233)；贵州省应用化学特色重点学科建设项目(黔教科研发[2012]442)；贵州师范学院博士基金项目(12BS032)

曹剑锋(1971-)，男，甘肃天水人，副教授，博士，主要从事天然药物研究。E-mail：cjf266@126.com

时间：2016-8-31 15：43：50

S859.3

A

1004-3268(2016)09-0130-05

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20160831.1543.001.html