王雅婷，蒋彩英

（浙江理工大学生命科学学院，浙江 杭州 310018）

家蚕miRNA及其在抗病毒机制中的作用

王雅婷，蒋彩英＊

（浙江理工大学生命科学学院，浙江 杭州 310018）

miRNA广泛存在于真核生物中，并在多种生理过程中发挥着重要的作用。本文简要介绍了家蚕miRNA及其在抗病毒机制中功能作用的研究进展。开展家蚕miRNA在家蚕抗病毒作用机制的研究，不仅有助于全面了解家蚕miRNA的功能及其调控机制，而且对于促进家蚕病毒病的早期诊断、防治和抗病育种具有重要意义。

家蚕；miRNA；抗病毒机制

1　引言

miRNA（microRNA、微RNA）是一类长约19～24个核苷酸（nucleotide，nt）的内源性非编码小分子单链RNA。在进化过程中，miRNA高度保守，并能通过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶基因mRNA降解或者抑制其翻译，广泛地负调控靶基因的表达［1］。据估计，生物体内miRNA数量约占其相应物种全部基因数的1%［2］。生物信息学数据显示，每个miRNA可以调节数百个靶基因，因此miRNA能调节多种生物学信号通路，进而调控多种重要生命活动，如生长与发育、细胞分化与凋亡、肿瘤发生以及对异源物（xenobiotics）的毒理学反应等［3，4］。越来越多研究发现，miRNA在免疫细胞的分化发育、免疫应答的调控以及免疫系统疾病的发生发展等过程中都发挥重要的作用［5，6］。miRNA因其在细胞基因表达调控网络系统中的重要作用，已成为当前生命科学研究的热点。

就昆虫而言，现已在miRBase数据库（Release 21：2014年6月）［7］中登录了26种昆虫3，824条成熟miRNA序列，其中以家蚕Bombyx mori（563条）、黑腹果蝇Drosophila melanogaster（466条）和赤拟谷盗Tribolium castaneum（430条）等的数量相对较多。至今，有关昆虫miRNA的研究主要以黑腹果蝇为主，包括miRNA鉴定、结构特征分析、生物合成途径和作用机制等研究［8，9］。近年来，有关家蚕miRNA研究发展十分迅速，新的miRNA不断被发现，揭示出不同miRNA在各种生物学功能方面起着非常重要的调控作用。

2　家蚕miRNA研究概况

目前，有关家蚕miRNA的研究主要集中在miRNA鉴定与表达、靶基因预测与验证、生长发育与丝蛋白合成等功能相关的研究［10］。

2.1家蚕miRNA鉴定与表达

miRNA鉴定主要通过生物信息学预测、miRNA芯片检测和文库构建及转录组测序等，再利用Northern杂交和RT-PCR等分子生物学技术进行验证。随着家蚕基因组测序的完成以及高通量测序技术的发展，越来越多的家蚕新miRNA被发现和鉴定。Tong等［11］率先通过生物信息学方法在家蚕基因组中鉴定出24个保守的miRNA。He等［12］利用芯片和Northern杂交技术鉴定了46个miRNAs、21个可能的miRNA和一个家蚕特有的miRNA，并预测了547个潜在的靶基因。Yu等［13，14］建立了家蚕不同发育时期的小RNA文库，采用计算机预测和分子克隆的方法，从中鉴定出了118个保守的miRNA和151个可能的家蚕特有的miRNA，并发现家蚕蜕皮期miRNA不但在种类上，而且在表达量上都有明显增加。根据miRNA序列的保守性，Huang等［15］通过同源性分析鉴定获得16个家蚕新miRNA，预测的21个潜在靶基因多是编码转录因子。通过芯片技术并结合Northern杂交，Liu等［16，17］研究了100个家蚕miRNA的时空表达情况。Zhang等［18］、Cai等［19］、Jagadeeswaran等［20］和Liu等［21］则分别利用SBS、Solexa和SOLiD等测序技术鉴定出新的miRNA，并根据其表达特征，推测有可能与家蚕的胚胎形成、变态发育和丝腺功能有关。

2.2家蚕miRNA功能研究

研究表明，家蚕miRNA在变态发育、神经发育、免疫反应和丝蛋白合成等多种生物学过程中均有重要作用。尽管通过miRNA芯片检测和转录组测序等技术发现了一大批在家蚕不同发育时期、不同组织器官以及病原物感染后差异表达的miRNA，但其中仅少数miRNA的功能得到了确证。家蚕miRNA功能及其调控机制的研究主要通过人为过表达或抑制表达目的miRNA后，检测其靶基因的表达水平以及家蚕生物学、生理生化和分子生物学等特征指标的变化，进而推测目的miRNA的功能。其中，采用双荧光素酶活性试验鉴定并验证家蚕miRNA与其靶基因的直接作用是当前研究miRNA功能的常用方法。

在家蚕中，Liu等［22］报道了bmo-let-7在不同发育时期和组织以及卵巢细胞中的表达情况，发现其表达模式与体内蜕皮激素的滴度之间存在一定的相关性。采用转基因方法降低家蚕体内bmo-let-7的表达水平后，发现转基因家蚕在蜕皮过程中出现发育停滞，且期间2个与蜕皮激素途径调控相关的bmo-let-7潜在靶基因FTZ-F1和Eip74EF（E74）的表达水平均有增高，因此推测bmo-let-7能调控家蚕的蜕皮过程［23］。类似地，bmo-miR-281可通过抑制其靶基因——蜕皮激素受体（ecdysone receptor，EcR）BmEcR-B基因的表达而参与马氏管的发育调控［24］。Chen等［25］报道bmo-miR-1a-3p能与Bm-VMP23基因的3’端非翻译区（3’UTR）特异性结合而导致BmVMP23基因下调，进而影响蚕卵致死性状。此外，Bmo-miR-9a可通过下调靶基因Bmase表达水平进而调控家蚕神经发育进程［26］；Bmo-miR-2作用靶基因awd和fng基因而影响蚕蛾翅形态［27］；bmomiR-7作用靶基因Bmyan而调控家蚕光感受器分化和复眼发育［28］。

家蚕miRNA在高龄幼虫后部丝腺中高水平表达，表明miRNA在丝蛋白合成中具有重要的调控作用［29，30］。Cao等［31］通过异源报告基因系统证实了丝素轻链基因（fibroin-L）至少被4个miRNA（miR-33、miR-190、miR-276和miR-7）所抑制；而Chen等［32］采用双荧光素酶活性试验证实fibroin-L基因亦能被在5龄幼虫后部丝腺高水平表达的bmo-miR-0001和bmo-miR-0015所显著下调。miRNA-2b能与家蚕丝素基因P25的3'UTR互补配对，且两者在5龄幼虫后部丝腺中的表达模式表明miRNA-2b可能是P25基因转录后水平的微调因子［33］。Wu等［34］预测发现丝素蛋白调节结合蛋白FMBP-1基因3’UTR中存在bmo-miR-2b*、bmo-miR-305和bmo-miR-2758的互补配对位点，经验证表明在后部丝腺中高水平表达的bmo-miR-2758能显著抑制FMBP-1基因的表达。

3　家蚕抗病毒研究

众所周知，家蚕是支撑全球蚕桑丝绸产业的生物学基础［35］。我国是世界上最大的蚕茧、蚕丝生产国和茧丝绸出口国［36］。蚕桑业在我国农业经济中占有重要地位，是农民收入的重要来源。然而，我国每年却因蚕病如病毒病、细菌病、真菌病和微粒子病等流行而造成的损失约占蚕业总收入的20%，由核型多角体病（Nuclear polyhedrosis）、质型多角体病（Cytoplasmic polyhedrosis）和浓核病（Densonuclopsis）等病毒病引发的损失约占蚕病总损失的80%，已严重影响到蚕桑产业的可持续发展。其中，家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV，一种昆虫杆状病毒）所引起的蚕脓病是养蚕业三大病毒病中危害最为严重的一种，在世界养蚕业国家常有暴发，并造成巨大的经济损失。长期以来，尽管在寻找抗病基因、阐明抗性机理培育抗性品种等方面研究己有一定的进展，但仍有较多问题尚未能解决［37，38］。

有关昆虫抗病毒机制的研究主要集中在RNA干扰和细胞凋亡等方面。研究发现，RNA沉默是昆虫用来抵御病毒入侵的一种普遍而又进化保守的防御机制［39～41］。由小干扰RNA（small interfering RNAs，siRNA）介导的RNA干扰在黑腹果蝇抗病毒防御机制中发挥重要作用。细胞凋亡（apoptosis）作为昆虫防卫病毒侵染的另一种重要机制，是通过细胞自杀性凋亡限制病毒感染与复制［42，43］。有关昆虫细胞凋亡调节分子与调节机制研究多限于果蝇、家蚕、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda和杆状病毒等［37］。虽然人们对昆虫细胞凋亡的分子机制已有大致了解，但与哺乳动物相比，许多细节更待继续阐明。

在家蚕中，从消化液内分离克隆获得了多个抗病毒蛋白，其中以中肠特异性表达的家蚕脂酶1（Bmlipase-1）［44］、丝氨酸蛋白酶2（BmSP-2）［45］和还原型辅酶Ⅱ氧化还原酶（BmNOX）［46］等对BmNPV具有较强抗性。Jiang等［47］采用转基因技术将Bmlipase-1基因转入家蚕敏感品系体内，获得的转基因家蚕对病毒感染后的存活率提高了33%。这在进一步确证Bmlipase-1抗病毒活性的同时，揭示了家蚕转基因抗病育种的应用前景。此外，采用荧光差异展示PCR技术（FDD-PCR）、芯片技术、酵母双杂、转录组与蛋白组测序等技术比较分析家蚕对病毒抗性和敏感品系、以及在病毒感染过程中差异表达的基因和蛋白，进而筛选家蚕抗病毒相关基因及其相关的信号转导途径［48～54］。其中，细胞凋亡可能也是家蚕对抗病毒感染的重要机制。家蚕核糖体S3A基因Bms3a在抗性品系感染病毒后高水平表达，推测该基因可能促进被病毒感染的家蚕细胞凋亡，进而抑制病毒在蚕体内的复制［48］。Qin等［55］采用遗传杂交和蛋白组测序技术鉴定发现细胞凋亡相关的半胱天冬酶caspase-1在家蚕抗BmNPV感染中具有重要作用。

4　miRNA在家蚕抗病毒机制中的作用

越来越多的研究表明，miRNA参与对病毒侵染免疫反应的调控过程［56～62］。由miRNA进行的转录后调控比转录调控和翻译后调控具有更好的精准性（robust）和更快的反应速度，因此在进化上更具优越性［63］。而且，每个miRNA分子通常可以调控数个目标基因，因此不同类型的调控通常交织在一个调控网络中。此外，病毒自身编码的miRNA对昆虫细胞基因表达的调控作用［64］，可能与昆虫miRNA的调控网络产生反馈互作，形成更为错综复杂的调控网络。

不同昆虫及细胞感染不同病毒后，其miRNA表达谱多会发生显著变化，如棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫［65］和草地贪夜蛾Sf9细胞［66］感染杆状病毒、谷实夜蛾H.zea脂肪体细胞HzFB感染烟芽夜蛾囊泡病毒（Heliothis virescens ascovirus，HvAV3e）［58］、致倦库蚊Culex quinquefasciatus雌成虫感染西尼罗病毒（WNV）［61］和埃及伊蚊Aedes aegypti雌成虫感染登革病毒（DENV）［67］等。miRNA表达谱的变化可能来自寄主本身的抗病毒反应，亦可能受病毒基因的调控而产生。

家蚕幼虫感染质型多角体病毒（BmCPV）后，在鉴定获得的316条已知miRNA和90条新miRNA中，有58条miRNA的表达量发生了显著变化，且这些差异表达miRNA的靶基因多涉及昆虫对病毒的免疫与应激反应［68］。其中，bmo-miR-278-3p在感染Bm-CPV后表达量显著下调，而在家蚕幼虫体内过表达bmo-miR-278-3p可显著抑制其靶基因——胰岛素相关肽结合蛋白（IBP2）基因表达，并促进BmCPV的复制［69］。这表明bmo-miR-278-3p可能参与家蚕对病毒的抗性。目前，家蚕miRNA抗病毒相关的研究尽管仍较为缺乏，但随着miRNA研究的不断深入，家蚕miRNA在抗病毒机制中作用会更为明确，并将用于家蚕病毒病的防治。Zhang等［70］利用miRNA的调控机理，构建了以BmNPV基因lef-1为靶基因的人工miRNA（amiRNA）表达系统，转染昆虫细胞后能产生具有抑制病毒复制并降低病毒感染的成熟amiR2764和amiR279。

5　展望

miRNA因其在细胞基因表达调控网络系统中的重要作用，现已成为生命科学研究的热点。但是，绝大多数miRNA的调控机制及其生物学功能至今尚未明了。有关miRNA免疫调控人类重大疾病如癌症、糖尿病和心血管疾病以及病毒传染病等方面的研究虽已有较多积累，但miRNA的功能机制及其调控网络仍在发掘当中。昆虫特别是家蚕的miRNA功能研究则相对滞后，有关miRNA抗病毒调控机制的研究尚待加强。

随着miRNA及其控调网络在家蚕抗病毒作用机制的阐明，不仅有助于全面了解家蚕miRNA的功能及其调控机制，而且对于促进家蚕病毒病的早期诊断、防治新途径和抗病育种具有重要意义。

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Research Progress of miRNA in the Silkworm，Bombyx mori and its Roles in Antiviral Mechanisms

WANG Ya-ting，JIANG Cai-ying＊
（College of Life Sciences，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

MiRNAs，found in eukaryotes，play important roles in various physiological processes through posttranscriptional regulation of gene expression.The research progress of miRNA in the silkworm，Bombyx mori and its roles in the antiviral mechanisms were introduced briefly in this paper.The research on the roles of miRNA in B.mori against viruses may not only contribute tounderstanding of B.mori miRNA functions，but also be important to promote early diagnosis of virus diseases，new approaches of disease defense and antiviral breeding of B.mori.

Bombyx mori；miRNA；antiviral mechanism

S884.5

A

0258-4069［2016］02-001-06

国家自然科学基金项目（31200974）

王雅婷（1991-），女，浙江台州人，硕士研究生，从事家蚕miRNA功能研究。E-mail：972099701@qq.com

蒋彩英，女，副研究员。E-mail：jcy@zstu.edu.cn