史玉，郭永泽，王建华,李校天

(1河北工程大学医学院，河北邯郸056029；2河北工程大学附属医院)



川芎嗪对重症急性胰腺炎大鼠的治疗作用及其机制

史玉1，郭永泽2，王建华2,李校天2

(1河北工程大学医学院，河北邯郸056029；2河北工程大学附属医院)

摘要：目的 探讨川芎嗪(TMP)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠的治疗作用及其机制。方法 采用5%牛磺胆酸钠溶液胰胆管注射诱发SAP大鼠模型。32只大鼠随机分为4组，A组(假手术组)、B组(SAP模型组)、C组、D组，每组8只。C组关腹30 min后腹腔内注射脂多糖(LPS,2 mg/kg体质量)，A、B组在关腹30 min后腹腔内注射与C组相同容积生理盐水，D组关腹30 min后腹腔内注射TMP(10 mg/ 100 g体质量)。干预后6 h，采用鲎试验检测血浆LPS；免疫组织化学法检测胰腺组织内Toll样受体4(TLR4)；荧光分光光度计检测胰腺腺泡细胞内钙离子浓度。结果血LPS水平、胰腺组织TLR4水平、胰腺腺泡细胞钙离子浓度B组均高于A组(P均<0.05)，C组均高于A组及B组(P均<0.05)；与B组相比，D组血LPS水平、胰腺组织TLR4水平、胰腺腺泡细胞内钙离子浓度明显下降(P均<0.05)。结论 TMP可通过干预LPS-TLR4通路缓解SAP大鼠胰腺腺泡细胞内钙超载，从而发挥其治疗作用。

关键词：重症急性胰腺炎；川芎嗪;钙超载；Toll样受体4

重症急性胰腺炎(SAP)病情凶险，病死率30%~40%[1]。目前认为胰腺腺泡细胞损伤促使多种炎性因子的瀑布样释放，引起炎症级联反应[2]，进而加重胰腺损伤。细胞内钙超载是胰腺腺泡细胞损伤的核心事件，调节胰腺细胞内钙离子的动态平衡,防止钙超载是治疗SAP的关键[3，4]。动物和临床试验研究表明，川芎嗪(TMP)可以缓解胰腺腺泡细胞钙超载，对SAP有一定治疗作用。以此为基础，2014年5~12月，我们从细胞和组织水平上，通过对SAP大鼠及胰腺腺泡细胞的研究，探讨TMP延缓腺泡细胞内钙超载的机制。

1材料与方法

1.1材料实验动物:成年健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，体质量250～300 g，清洁级，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。实验过程符合中华人民共和国的《实验动物管理条例》及伦理要求。实验药品及主要试剂：牛磺胆酸钠、LPS购自Sigma 公司；TMP购自中国药品生物制品检定所；内毒素试剂盒购自上海市医学化验所；兔抗TLR4多克隆抗体购自Santa Cruz公司；显色法免疫检测试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2动物模型制备及分组采用5%牛磺胆酸钠溶液胰胆管注射诱发SAP大鼠模型。具体操作如下：动物用氯胺酮100 mg/ kg体质量腹腔注射麻醉后开腹,暴露胰胆管，在胰胆管出肝门端及肠端用丝线及动脉夹暂阻断, 从近肝门端向胰胆管内加压注射5%牛磺胆酸钠溶液(0.1 ml/ 100 g体质量),10 min后去除结扎线及动脉夹。注射后约10 min见胰腺出现肿胀及点状出血坏死，标志造模成功，关腹。假手术组鼠仅做剖腹并轻翻动胰腺。32只模型大鼠随机分为四组：A组(假手术组)、B组(SAP模型组)、C组、D组，每组8只。C组关腹30 min后腹腔内注射脂多糖(LPS，2 mg/kg体质量)，A组、B组在关腹30 min后腹腔内注射与C组相同容积生理盐水，D组关腹30 min后腹腔内注射TMP(10 mg/ 100 g体质量)。干预后6 h，所有动物同批麻醉后，心脏采血备用。取新鲜胰腺组织分离胰腺腺泡细胞。

1.3血浆LPS的检测采用鲎试验动态浊度法。按说明书操作。各组取0.1 mL血浆加入0.9 mL样品处理液中，70 ℃孵育10 min，然后冷却5 min。取上述样品0.2 mL加入酶反应液中混匀，取0.1 mL混悬液加入微孔平板仪，再加0.1 mL鲎试剂混匀，上检测仪器检测。

1.4胰腺组织内TLR4的检测采用免疫组织化学SP法。胰腺组织石蜡切片5 mm，经脱蜡至水、微波抗原修复，加兔抗TLR4多克隆抗体(1∶80)，二抗，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗进行上述染色作为空白对照。切片统一由专门病理医师在光镜下观察，应用图象分析软件计算阳性面积。

1.5胰腺腺泡细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的检测采用荧光分光光度计检测。按胶原酶法分离提纯大鼠原代胰腺腺泡细胞, 制成密度为105~106/L的细胞悬液(经台盼蓝染色测定细胞存活率达90%以上)，在37 ℃的水浴中预温5 min，加入荧光探针Fura-2/AM 37 ℃避光孵育1 h,每隔10分钟振荡1次。染色结束后，用D-Hanks液洗细胞3次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料，用荧光分光光度计检测荧光强度，以340、380 nm双波长激发样品, 发射波长510 nm。[Ca2+]i计算公式:[Ca2+]i=Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Fmin/Fmax)。

2结果

各组血浆LPS、胰腺TLR4阳性面积及腺泡细胞[Ca2+]i比较见表1。

表1　各组血浆LPS、胰腺TLR4阳性面积

注 与A组比较，*P<0.05; 与B组比较,#P<0.05；与C组比较，@P<0.01。

3讨论

临床试验和动物实验研究证实，SAP患者和动物模型的血液中LPS 水平明显升高[5,6]，后者可激活LPS-TLR4 通路，使SAP加重，对胰腺组织造成“二次打击”。目前关于LPS-TLR4 参与SAP发生机制的研究主要集中在其下游细胞因子的炎性作用。其是否还通过其他途径引起胰腺损伤尚未见报道。越来越多的实验结果证实,胰腺腺泡细胞内Ca2+超载是SAP发生发展的“扳机点”。两者之间是否相关、相关性如何目前尚不清楚。本实验结果显示,诱导SAP后,大鼠血浆LPS水平明显升高，胰腺组织TLR4蛋白表达水平明显增加，同时胰腺腺泡细胞[Ca2+]i升高。在此基础上,给SAP大鼠腹腔内注射LPS,可见胰腺组织TLR4蛋白表达水平及腺泡细胞[Ca2+]i升高更明显。说明在SAP发生时, 随着LPS-TLR4 通路的活化，胰腺腺泡细胞[Ca2+]i明显增加,并由此加重了胰腺损伤。

TMP是从中药川穹中分离提纯的生物碱单体，又称四甲基吡嗪。 研究[7，8]发现TMP对SAP大鼠有一定的治疗作用，其可能机制之一是抑制胰腺细胞钙超载[9]。但是其抑制钙超载的相关信号通路未见报道。研究[10]发现TMP具有一定的抗LPS药理作用,对LPS诱导的急性肺损伤大鼠有保护作用[11]。据此,我们推测其可能对LPS-TLR4通路有影响。本试验结果显示，TMP可以降低SAP大鼠血浆LPS含量及胰腺组织TLR4水平，进而缓解腺泡细胞钙超载，这说明TMP可以减轻LPS-TLR4通路诱导的腺泡细胞钙超载。

综上所述，TMP可以通过干预LPS-TLR4通路缓解钙超载，从而发挥其治疗作用，为临床采用TMP治疗SAP提供理论指导。至于LPS-TLR4通路具体通过何种信号分子影响了腺泡细胞内钙信号，需要进一步研究。

参考文献：

[1] Imrey PB, Law R. Antibiotic prophylaxis for severe acute pancreatitis[J]. Am J Surg, 2012,203(4):556-557.

[2] Nepomnyashchikh LM, Lushnikova EL, Viskunov VG, et al. Ultrastructure of acinar cell injuries in experimental acute pancreatitis created by common bile duct ligation[J]. Bull Exp Biol Med, 2011,150(6):747-752.

[3] 蒲青凡,孙碎康,张川蓉,等.改善微循环和防止细胞钙超载在阻止急性胰腺炎重症化治疗中的作用[J].临床外科杂志,2002,10(1):17-19.

[4] 孙红,刘戟.腺泡细胞钙超载与急性胰腺炎关系研究进展[J].重庆医学,2013,42(31):3826-3829.

[5] Zhongkai L, Jianxin Y, Weichang C. Vasoactive intestinal peptide promotes gut barrier function against severe acute pancreatitis[J]. Mol Biol Rep, 2012,39(4):3557-3563.

[6] Liu Z, Ma Y, Qin H. Potential prevention and treatment of intestinal barrier dysfunction using active components of Lactobacillus[J]. Ann Surg, 2011,254(5): 832-833.

[7] 张家衡,金太欣.川芎嗪对急性胰腺炎的作用[J].中华实验外科杂志,2007,24(7):829-831.

[8] 周春立,顾振纶,梁中琴,等.川芎嗪对大鼠重症急性胰腺炎的实验研究[J].湖南中医药大学学报,2011,31(10):3-6.

[9] 王兴鹏,徐家裕,袁耀宗,等.川芎嗪对急性胰腺炎大鼠胰腺细胞保护作用的机制[J].中华医学杂志,1996,76(11):61-62.

[10] 胡屹屹,何孔旺,俞正玉.青藤碱、吴茱萸碱和川芎嗪抗细菌内毒素作用及其机制研究[J].南京农业大学学报,2012,35(1):103-107.

[11] 张高峰,赵士弟,李佳,等.川芎嗪对内毒素诱导大鼠急性肺损伤的保护作用[J]. 蚌埠医学院学报, 2014,39(8):997-1000.

(收稿日期：2015-09-07)

中图分类号：R576

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)01-0033-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.011

通信作者：郭永泽(E-mail:guoyongze69@126.com)

基金项目：河北省科学技术厅资助项目(10276105D-49); 邯郸市科学技术技局资助项目(0823108067-2)。