刘晨敏， 韩雨哲，任同军　(大连海洋大学，农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连 116023)



饲料中不同赖氨酸水平对急性高温胁迫后刺参非特异性免疫酶活性的影响

刘晨敏， 韩雨哲*，任同军(大连海洋大学，农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连 116023)

摘要[目的] 研究饲料中不同赖氨酸水平对急性高温胁迫后刺参非特异性免疫酶活性的影响。[方法] 试验配制赖氨酸含量分别为0.28%(Ⅰ组)、0.64%(Ⅱ组)、1.19%(Ⅲ组)、1.89%(Ⅳ组)和2.23%(Ⅴ组)的5种刺参试验饲料，用以投喂体质量(1.55 ± 0.01)g的刺参。56 d养殖试验(养殖期间水温控制在(18±1) ℃)结束后，对刺参进行急性高温(28 ℃)刺激，1.5 h后测定其体腔液酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶活性(CAT)和总抗氧化能力(T-AOC)。[结果] 高温刺激下，随着赖氨酸添加量的提高，刺参体腔液中的ACP活性呈先升高后下降的趋势。当赖氨酸含量为1.89% 时ACP活性最高，其AKP和T-AOC活性的变化趋势与ACP基本相同。CAT活性随着赖氨酸含量的增加而升高，当赖氨酸含量为1.19% 时CAT活性达到最大值，此后呈现下降趋势。[结论] 饲料中添加适量的赖氨酸能改善刺参体腔液非特异性免疫酶活性，增强其对急性高温胁迫的适应性并提高其存活率。刺参饲料中赖氨酸的适宜添加范围为1.19%～1.89%。

关键词刺参；赖氨酸；急性高温胁迫；非特异性免疫

刺参因其具有较高的营养和药用价值，近年来成为我国北方地区重要的养殖品种之一[1]。刺参属于变温性海洋动物，环境温度的变化对其生长、发育和疾病抵抗力有重大影响。自然海域或池塘养殖及刺参商品运输过程中都有可能遭遇急性温度变化，温度的骤然升高会造成机体自由基代谢的紊乱，使得机体内自由基大量积累，从而损害了机体细胞和组织正常的生理和免疫防御能力，进而容易感染病原生物或者在携带病原生物时容易发病[2]。目前，关于高温对水生动物免疫指标的影响研究比较广泛。宋林生等[2]研究了温度骤升对中华绒螯蟹一些免疫化学指标的影响。曹学顺等[3]研究了升温对“水院1号”和大连养殖刺参非特异性免疫的影响。赖氨酸是鱼粉替代植物性蛋白源饲料的第一限制性氨基酸或第二限制性氨基酸，是机体不能合成的必需氨基酸之一，其对维持水生动物的正常生长、发育、神经系统的正常机能和提高免疫力等方面具有重要作用[4]。近年来，有关赖氨酸方面的研究报道较多，但在高温胁迫条件下饲料中赖氨酸的不同水平仅现于对畜禽类生物的生长和发育等少数领域的报道。陈燕等[5]研究表明在环境高温下通过补充合成的必需氨基酸，降低饲料粗蛋白水平能够显著降低肉鸡的氨氮排泄量，而不影响其生产性能。在31 ℃高温环境条件下，饲料中的赖氨酸含量为1.3%时，可以显著提高猪的日增重和肉料比[6]。目前，关于饲料中不同赖氨酸水平对温度骤升胁迫后刺参非特异性免疫酶的影响尚鲜见报道。笔者研究了饲料中赖氨酸水平对急性高温胁迫后刺参体腔液中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶(CAT)活力的影响，旨在为赖氨酸在刺参可持续养殖方面的应用提供试验依据。

1材料与方法

1.1试验材料试验用刺参幼参采自大连水益生海洋生物技术有限公司，从 3 000头幼参中随机选取大小相等、体质健壮的刺参540头(初始体质量为(1.55 ± 0.01) g)进行试验；试验所用的晶体氨基酸均由生工生物工程(上海)股份有限公司生产。

1.2仪器与试剂

1.2.1试剂。酸性磷酸酶测定试剂盒、碱性磷酸酶测定试剂盒、总抗氧化能力测定试剂盒和过氧化氢酶测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.2.2仪器。超微粉碎机(SB500克型)，为上海广泛工贸有限公司产品；60℃恒温嘉风干燥箱(DHG-9240A型)，为上海一恒科技有限公司产品；制粒机，为常州品正设备有限公司产品；高压蒸汽灭菌锅(MLS-3781L-PC，Panasonic);加热棒(XL-999)，为祥龙电器有限公司产品。

1.3试验饲料以马尾藻、酪蛋白、明胶、晶体氨基酸的混合物为蛋白源，配制成含赖氨酸含量分别为0.28%(Ⅰ组)、0.64%(Ⅱ组)、1.19%(Ⅲ组)、1.89%(Ⅳ组)和2.23%(Ⅴ组)的5种刺参幼参半精制试验饲料(试验饲料组成见表1，其营养成分见表2)。其中，必需氨基酸混合物和非必需氨基酸混合物成分分别见表3和4。

试验饲料中除赖氨酸外的其他氨基酸的组成模式与刺参整体蛋白的氨基酸组成模式一致。配制饲料参考Han等[7]的方法，略有改动。配制饲料前，饲料原料使用超微粉碎机粉碎至180目(粒径为80 μm)以上。饲料中的晶体氨基酸按饲料配方比例称取后均经过预混，并用糊化的羧甲基纤维素钠包被并置于60 ℃恒温鼓风干燥箱中烘干后粉碎；与酪蛋白、明胶混合后添加到其他干物质混合物中，并加入适量的水后混合均匀，为进一步提高饲料的水稳定性，再次加入80 ℃水浴下糊化的卡拉胶混合均匀，随后添加鱿鱼肝油和适量的水充分混匀形成面团混合物后用制粒机挤压制成颗粒饲料 (颗粒直径为1.8 mm)，于60 ℃恒温鼓风干燥箱中烘干。为了进一步提高饲料的水稳定性，将5组烘干的饲料放在高压蒸汽灭菌锅中蒸1 min后，阴干装袋后置于-20 ℃冰箱中备用。

注：酪蛋白、明胶、羧甲基纤维素钠和卡拉胶均由上海生工生物科技有限公司生产；所有氨基酸均是L-型，由上海生工生物科技有限公司生产；诱食剂：5 g 牛磺酸和5 g甜菜碱。每千克预混料含有维生素和微量元素:维生素A 600 mg、维生素C 2 000 mg、维生素D312.5 mg、维生素E 20 000 mg、维生素K34 000mg、维生素B15 000 mg、维生素B210 000 mg、维生素B612 000 mg、维生素B1220.0 mg、烟酸6 000 mg、泛酸钙6 000 mg、叶酸400 mg、肌醇15 000 mg、生物素50.0 mg、铁5 000 mg、铜1 000 mg、锰2 500 mg、锌1 500 mg、硒30.0 mg。

Note: Casein,gelatin,sodium carboxymethylcellulose and К-carrageenan were all produced by Shanghai Sagon Biotech Co.,Ltd.All the amino acids were L-type and produced by Shanghai Sagon Biotech Co.,Ltd.Attractants：5 g taurine and 5 g betaine.Premix per kilogram included the following vitamins and microelements：600 mg vitamin A,2 000 mg vitamin C,12.5 mg vitamin D3,20 000 mg vitamin E,4 000 mg vitamin K3,5 000 mg vitamin B1,10 000 mg vitamin B2,12 000 mg vitamin B6,20.0 mg vitamin B12,6 000 mg niacin,6 000 mg pantothenic acid - Ca,400 mg folic acid,15 000 mg inositol,50.0 mg biotin,5 000 mg Fe,1 000 mg Cu,2 500 mg Mn,1 500 mg Zn,and 30.0 mg Se.

1.4饲养管理试验刺参送至实验室后先置于2个500 L水槽中暂养驯化7 d。试验共设置 5个处理组，每组3个平行，共15个水族箱，每箱30头刺参。试验养殖系统为循环水系统(每箱进水速率为9 L/h)，试验用水族箱为容积35 L的长方形玻璃纤维水缸，水源为经沙滤和海绵、活性炭过滤后的海水。一个200 L的水槽用于盛装沙滤海水，并使用加热棒加热，使水温保持在(18 ± 1) ℃，作为更换水的水源。整个养殖试验期间，每天清理粪便和收集残饵，并换水1次，换水量为1/4，主要补充蒸发及收集残饵、粪便时损失的水分，每天16:30投喂1次(起始投饵量5%)，根据情况适当调整饲喂量，达到饱食投喂。养殖期间，水温保持在(18±1) ℃，盐度保持在(30±1)‰，pH保持在(7.7 ± 0.2)，全天连续充氧，全天进行避光处理。

1.5急性高温处理方法取一个50 L水槽加入适量的海水，使用加热棒加热并使海水维持在28 ℃，将5个贴有标签的1 000 mL的烧杯依次加入温度28 ℃的养殖海水800 mL，每个烧杯保持连续充氧。56 d养殖试验结束后，从每个水族箱中随机选取3头刺参，并将各处理组3个平行的刺参合并置于在对应编号的烧杯中1.5 h。

1.6样品收集及指标测定

1.6.1样品收集。高温处理试验结束后，每个处理组的刺参全部取出并进行免疫酶活性的测定。将取出的刺参置于冰盘上进行体腔液的采集，于4 ℃、3 000 × g低温冷冻离心机中离心20 min， 取上清液分装于 2.0 mL的离心管中，置于-80 ℃冰箱中备用，用于体腔液免疫酶的测定。

注：色氨酸在水解过程中遭到破坏，未被检出。

Note：Tryptophan was destroyed during hydrolytic process,so that it was not detected.

1.6.2指标测定。ACP、AKP、T-AOC 及CAT活性均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定。ACP和AKP活性单位的定义为： 每克样品蛋白在37 ℃与基质反应30 min产生1 mg酚，为1个酶活性单位；T-AOC活性单位的定义为：在37 ℃时，每分钟每毫升血清(浆)使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为1个总抗氧化能力单位。CAT活性单位的定义为： 每毫升血清或血浆每秒钟分解1 μmol的过氧化氢的量为1个活力单位。

1.7数据处理试验数据均以平均值±标准误表示，使用SPSS 13.0软件包(Chicago,IL,USA)对试验数据进行统计与分析，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行组间显著性检验。若差异显著(P<0.05)，采用 Duncan’s法进行多重比较分析。

2结果与分析

2.1酸性磷酸酶活性从图1可以看出，急性高温处理后，随着饵料中赖氨酸含量的增加，刺参体腔液中ACP活性呈先升高后下降的趋势，Ⅳ组ACP活性达到最大值，并显著高于Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ组(P<0.05)，但与Ⅲ组无显著差异(P>0.05)。

2.2碱性磷酸酶活性从图2可以看出，急性高温处理后刺参体腔液中AKP活性随着饵料中赖氨酸含量的增加呈先升高后下降的趋势。Ⅳ组AKP活性最高，Ⅲ组次之，但Ⅲ组和Ⅳ组均显著高于Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ组(P<0.05)。

2.3总抗氧化能力从图3可以看出，急性高温处理后，刺参体腔液中T-AOC活性随饵料中赖氨酸含量的增加呈先升高后下降的趋势。Ⅳ组刺参的T-AOC活性最高，并显著高于Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ组(P<0.05)，但与Ⅲ组无显著差异(P>0.05)。

2.4过氧化氢酶活性从图4可以看出，急性高温处理后，Ⅲ组刺参体腔液中CAT活性显著高于Ⅰ和Ⅱ组(P< 0.05)，但与Ⅳ和Ⅴ组无显著差异(P>0.05)。

3讨论与结论

水温作为最重要的生态因子之一，对刺参生长和生理状态起到非常重要的作用[8]。刺参的最适生长温度为15～18 ℃[9]，若超过适宜温度会导致刺参体内代谢紊乱，免疫功能降低，从而诱发疾病。刺参是一种低等的营底栖碎屑食性生物[10]并且特异性免疫机制不完善，主要依靠非特异性免疫来提高对疾病的抵抗力，其体腔液AKP、ACP、T-AOC及CAT活性是反映机体免疫能力的重要非特异性免疫酶，在机体防御反应中发挥着重要作用[11]。

刺参免疫反应主要包括细胞免疫和体液免疫，二者紧密联系，吞噬作用是机体内部防御的第一道防线，在机体的所有免疫应答中居于重要地位[12]。吞噬完成后，吞噬细胞主要通过ACP和AKP来降解外源物质[13]。ACP和AKP是软体动物溶酶体酶的重要组成部分，在免疫反应中发挥作用[14]，二者在甲壳动物的防御机制中直接参与磷酸基团的转移和代谢，可以加速物质的摄取和转运，形成水解酶体系，破坏和消除侵入体内的异物，达到机体防御的功能[15-16]。方美娟等[17]研究发现低温和高温都会使Hemibarbusmaculates的ACP和AKP活性显著降低，导致免疫力下降，出现死亡。赵春蓉[18]研究表明饲料添加适量的稳定化的赖氨酸能够显著提高幼建鲤的AKP活性，增强其免疫功能。鄢华[19]研究表明饲喂赖氨酸缺乏饲料，能显著降低幼建鲤的ACP活性和疾病抵抗能力。该研究结果表明在急性高温胁迫下刺参体腔液中的ACP和AKP活性随饲料中赖氨酸含量的升高呈现先升高后下降的趋势。推测这种现象的原因可能是急性高温胁迫导致刺参体内的代谢发生紊乱，而刺参体内的吞噬作用被摄入的赖氨酸所激发，进而使ACP和AKP的活性发生变化，以提高其免疫功能。饲喂添加1.89% 赖氨酸饲料的处理组刺参ACP和AKP酶活性最高。由此可见，当饲料中赖氨酸的添加水平为1.89% 时，能显著提高刺参的ACP和AKP活性。

T-AOC是生物体对外来刺激的应激能力，是衡量机体抗氧化系统功能状态的综合性指标[20]。T-AOC水平的高低反映机体抗氧化酶系统和非酶促体系对外界刺激的应激能力[21]。CAT是抗氧化体系中重要的一种酶，也是生物体内过氧化物酶体的标志酶[22]，它与过氧化氢结合，分解细胞代谢产生的过氧化氢为水和氧气，从而清除过氧化氢，防止羟基自由基的形成[23]。宋林生等[2]研究发现温度骤升会严重影响中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)机体的免疫防御能力，使机体抗氧化酶活力发生显著变化，导致自由基代谢异常。张婷[24]研究表明饲粮中添加1.17%的赖氨酸可以显著增强笼养蛋雏鸭的血清T-AOC及血清和肝脏总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。在该研究的急性高温胁迫试验中，刺参体腔液中的T-AOC和CAT水平均随着饲料赖氨酸水平的升高呈现出先升高后降低的趋势，当饲料赖氨酸水平为1.89% 时T-AOC高于其他处理组，当赖氨酸水平为1.19% 时CAT活性达到最大值，但与Ⅳ(饲料赖氨酸含量为1.89%)组无显著差异。造成这一趋势的原因可能是急性高温胁迫导致机体活性氧自由基代谢的紊乱而瞬间增多，当饲料中赖氨酸的添加量为1.89% 时显著提高了刺参体内的CAT活性及细胞中其他大量酶或非酶物质来提高抗氧化防御机制，从而清除多余的活性氧自由基，但随着高温胁迫时

间的延长和饲料中赖氨酸含量的增加，抗氧化体系中的各种酶类活性因消耗或因被抑制而降低，从而导致CAT活性和T-AOC水平下降。

笔者展开的为期56 d的养殖试验结束后，对养殖刺参的生长指标(主要包括终末体重、体增重、特殊增长率及存活率)进行了测定。结果表明饲喂不同赖氨酸水平饲料的刺参的终末体重、体增重、特殊增长率及存活率的最大值基本均出现在赖氨酸含量为1.19%的Ⅲ组。从免疫角度来看，含1.19%赖氨酸的Ⅲ组刺参体腔液中的ACP、AKP、T-AOC和CAT活性与赖氨酸含量为1.89%的Ⅳ组无显著差异，并且CAT活性在赖氨酸含量为1.19%的Ⅲ组取得最大值。综合考虑生长指标和免疫酶活性，刺参饲料中赖氨酸的最适添加范围为1.19%～1.89%。

该试验结果表明饲料中添加适量的赖氨酸能够显著改善刺参体腔液非特异性免疫酶活力，增强其对急性高温胁迫的抵抗力并提高其存活率，刺参饲料中赖氨酸的适宜添加范围为1.19%～1.89%。

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Effects of Dietary Lysine Level on Non-specific Immune Enzyme Activities ofApostichopusjaponicusafter Acute Heat Stress

LIU Chen-min,HAN Yu-zhe*,REN Tong-jun

(Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian,Liaoning 116023)

Key wordsApostichopusjaponicus; Lysine; Acute heat stress; Non-specific immune

Abstract[Objective] To research the effects of dietary lysine level on non-specific immune enzyme activities ofApostichopusjaponicusafter acute heat stress.[Method] Lysine contents were designed to be five groups of 0.28% (group Ⅰ)，0.64% (group Ⅱ)，1.19% (group Ⅲ)，1.89% (group Ⅳ) and 2.23% (group Ⅴ),which were used to feedA.japonicuswith the body weight being (1.55 ± 0.01) g.After the end of feeding trial for 56 d(water temperature maintained at 18 ± 1 ℃),acute heat temperature (28 ℃) stimulation ofA.japonicuswas carried out.Acidic phosphatase (ACP),alkaline phosphatase (AKP),catalase activity (CAT) and total antioxidant capacity (T-AOC) of coelomic fluid were detected at 1.5 h.[Result] Under the stress of high temperature,ACP activity in coelomic fluid ofA.japonicusfirstly enhanced and then declined as the adding amount of lysine increased.When lysine content was 1.89%,ACP activity was the maximum.AKP and T-AOC activities had basically the same change trend with ACP.CAT activity enhanced as the lysine content increased,and reached the maximum value when lysine content was 1.19%,and then showed a downward tendency.[Conclusion] Adding proper amount of lysine in feedstuff improves the nonspecific immune enzyme activity in coelomic fluid ofA.japonicus, and enhances the survival rate and adaptability under acute heat stress.The suitable adding range of lysine inA.japonicusfeedstuff is 1.19%-1.89%.

基金项目国家海洋公益项目(201405003)；大连市科技兴海项目(20140101)。

作者简介刘晨敏(1988- )，女，河南商丘人，硕士研究生，研究方向：生理学。*通讯作者，讲师，博士，硕士生导师，从事水产动物营养学和水族科学方面的研究。

收稿日期2016-01-26

中图分类号S 963

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)07-092-04