韩贵芝， 王文军， 王 芳　 (济宁医学院公共卫生学院，山东济宁 272013)



高效液相色谱法测定大蒜中大蒜素的含量

韩贵芝， 王文军， 王 芳 (济宁医学院公共卫生学院，山东济宁 272013)

摘要[目的]通过有机萃取法中萃取剂的选择、用量和萃取时间等条件的优化处理，建立大蒜中大蒜素含量测定的分析方法。[方法]将新鲜大蒜捣碎、酶解后，分别用乙醇和乙酸乙酯作为萃取剂萃取得到大蒜素溶液。用高效液相色谱仪分析样品中大蒜素的含量,确定最佳萃取剂；通过对不同时间段提取物检测对比，确定最佳萃取时间。[结果]以乙醇作为萃取剂提取大蒜素，大蒜素的平均浓度可以达到28.85 μg/mL，乙酸乙酯提取组中的大蒜素平均浓度为13.24 μg/mL；经对比分析，乙醇提取大蒜素的最佳萃取时间为3.0 h。[结论]乙醇作为实验室常用的化学试剂具有低毒、无污染、高效的提取效果，可为医药、食品等实验室对大蒜素的提取开发和利用提供参考。

关键词乙醇；乙酸乙酯；大蒜素；萃取时间优化

大蒜为百合科葱属植物，在我国有2 000多年的种植历史。大蒜属药食同源植物，其鳞茎中富含钙、铁、锌、锗等元素以及多种必需氨基酸[1-5]，具有较高的食用和药用价值，能有效防治高血压等疾病。在传统医学中，大蒜也是一味中草药，能够激发免疫功能，诱生出干扰素，抑制生成肿瘤坏死因子，降低致癌物的作用，具有提高人体免疫功能的重要作用[6]。大蒜中的有机含硫化合物——大蒜素，其化学名称是二烯丙基三硫化物(DATS)。新鲜完整的大蒜中并不含大蒜素，只含有其前体物质——蒜氨酸。蒜氨酸存于大蒜的细胞质中，但当大蒜的细胞破碎后，液泡内的内源蒜酶被释放并与蒜氨酸接触，经酶解生成大蒜素。现代医学研究得出，大蒜素的药理作用包含以下几种：抗微生物、抗肿瘤、抗寄生虫、抗溃疡、抗衰老、降血压、降血脂、提高机体免疫力等[7-8]。大蒜素使用安全，不良反应少，具有广阔的应用前景。因此，大蒜素的开发和研究越来越受到人们的重视。

目前，对大蒜素的提取和测定已有一定的研究，其中有机溶剂提取法、水蒸气蒸馏法和超临界CO2萃取法是最常用的提取大蒜素的3种方法[9-11]。水蒸气蒸馏法具有成本低、设备简单等优点，但因操作过程中温度相对较高容易降低蒜酶的活性，降低大蒜素产率。超临界CO2萃取法因具有工艺简单、高效节能等优点而在化工、食品和医药等领域广泛应用，但该法所用设备投资较大，不适于实验室提取。笔者采用有机溶剂萃取法萃取大蒜中的大蒜素，并采用高效液相色谱法(HPLC)进行检测，比较其萃取效果，并优化萃取时间 ，以期能够提高大蒜素的产率。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料及试剂。市售普通大蒜；大蒜素标准品，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司；乙醇(分析纯)；乙酸乙酯(分析纯)；甲醇(高效液相色谱专用)。

1.1.2主要仪器。500 mL烧杯、100 mL容量瓶、漏斗、锥形瓶、JJ-2(2003-61)型组织捣碎匀浆机，常州国华电器有限公司；HH·S21·6型双列六孔电热恒温水浴锅，山东医疗器械厂；TD5M-WS多管架自动平衡离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；RE-48转蒸发仪器，上海亚荣生化仪器厂；LC210型高效液相色谱仪，上海仪电分析仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1色谱条件。该试验参照张民等用HPLC法测定大蒜中大蒜素含量所用色谱条件[12]。色谱柱：C18柱，流动相为甲醇∶水为85∶15(V/V)，柱温30 ℃，流速为0.8 mL/min，检测波长为214 nm，每次进样20 μL。

1.2.2大蒜素样品的制备。将新鲜大蒜去皮，用组织捣碎机捣碎成蒜泥，取3份样品,每份20 g,分别用保鲜膜密封，利用大蒜细胞破碎后释放的内源蒜酶常温酶解30 min，按照料液比1∶4 g/mL向样品中分别加入等量乙醇。用保鲜膜密封置于40 ℃恒温水浴锅中浸提1 h后，将样品转移至离心管以1 000 r/min低速离心沉淀，取上清液，使用旋转蒸发仪进行蒸馏，温度设定为78 ℃，转速70 r/min,待体积减至原来的1/4时停止蒸馏，过滤即得浓缩大蒜素液。使用乙酸乙酯作为萃取剂提取大蒜素的步骤与乙醇相同。

1.2.3标准曲线的绘制及样品测定。以流动相作为溶剂将大蒜素纯品制备成200 μg/mL的大蒜素标准储备液，再用流动相稀释为100.00、50.00、25.00、12.50 μg/mL的系列溶液，经微孔滤膜过滤后分别精密进样20 μL，使用高效液相色谱仪对标准系列中大蒜素含量进行测定，以大蒜素浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标做标准曲线，得回归方程。分别准确量取1 mL浓缩大蒜素液，用流动相定容至10 mL，微孔滤膜过滤后分别进样20 μL进行检测，根据对待测物质所得峰面积计算得出样品中大蒜素的含量。

1.2.4萃取时间优化。分别取40 g捣碎大蒜置于5个烧杯中，编号A、B、C、D、E，经酶解、匀浆后，按照料液比1∶4 g/mL加入提取效果较好的溶剂分别置于40 ℃水浴锅中萃取1、2、3、4、5 h，经旋转蒸发仪蒸馏、过滤制得大蒜素浓缩液。用微孔滤膜分别对样品进行过滤，按照前述色谱条件对5份样品中大蒜素的含量进行测定、比较，确定最佳萃取时间。

1.2.5回收率试验。精确量取已知大蒜素含量的样品，向其中加入不同浓度的大蒜素标准品，按照前述色谱条件测定大蒜素的加标回收率。

2结果与分析

2.1大蒜素样品的高效液相色谱图图1为乙醇提取组中大蒜素含量的色谱图，大蒜素的保留时间为6.084 min，图2为乙酸乙酯提取组中大蒜素含量的色谱图。

2.2大蒜素的标准曲线取“1.2.3”中所配制的大蒜素标准系列溶液分别进样，记录峰面积，以大蒜素浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标作标准曲线，得回归方程：A=15 950C+74 949，r=0.999 050。

2.3乙醇和乙酸乙酯的提取效果比较由表1可知，乙醇较乙酸乙酯对大蒜素的提取率高，且乙醇对人体相对无毒副作用，故选择使用乙醇提取大蒜中的大蒜素。

2.4萃取时间的优化选取乙醇作为萃取剂，按照“1.2.4”的方法对大蒜素的萃取时间进行优化。由图3可知，当萃取时间为3.0 h时，所得提取物中大蒜素的浓度最高，故乙醇提取大蒜素的最佳时间为3.0 h。

2.5回收率测定精确量取1 mL浓度为31.79 μg/mL的样品溶液，再分别加入1 mL不同浓度的大蒜素标准品，按前述色谱条件对混合液中的大蒜素进行测定，计算回收率。由表2可见，大蒜素的加标回收率在84.4%～88.2%，平均回收率86.4%,而测定结果在80%～120%即可视为优化方法可行。因此，该试验采用的方法可行。

3结论与讨论

大蒜素为无色油状液体，难溶于水，但易溶于有机溶剂如乙醇、乙酸乙酯、乙醚等中。该研究采用乙醇作为萃取剂提取大蒜素的工艺,得出最佳工艺条件为:大蒜细胞破碎后常温酶解30 min，加入乙醇，置于40 ℃恒温水浴锅中浸提1 h后，使用旋转蒸发仪78 ℃蒸馏，得浓缩大蒜素液，用HPLC法对样品中大蒜素含量进行测定，当萃取时间为3.0 h时，所得提取物中大蒜素的浓度最高。

在实验室中提取大蒜素主要用于食品工业的研究，应选用无毒或低毒的萃取剂，故选乙醇作为萃取剂，且提取结束后，所得大蒜素产品中无不良气味，优化了大蒜素的提取方法。该方法萃取率高，加标回收率高，线性关系好，可为医药、食品等实验室对大蒜素的提取开发和利用提供参考依据。

参考文献

[1] 宋卫国,李宝聚,刘开启.大蒜化学成分及其抗菌活性机理研究进展[J].园艺学报,2004,31(2):263-268.

[2] 郑永军.基于分子印迹技术的大蒜功能成分的分离提取及药理活性研究[D].青岛:中国海洋大学，2012.

[3] 初乐,赵岩,周元忻,等.超临界CO2萃取大蒜素的研究[J].农产品加工(学刊)，2013(3):33-34,40.

[4] 王红庆,余荣珍.火焰原子吸收法测定大蒜中的微量元素[J].湖北农业科学,2009,48(9):2242-2243.

[5] 杨瑾,陈坚,李新霞,等.高效液相衍生化法测定大蒜氨基酸指纹图谱[J].新疆医科大学学报,2010,33(5):509-511.

[6] 贾玉山,格根图,董占元,等.大蒜调控肉牛免疫功能研究[J].中国饲料，2004(9):13-16.

[7] BALASENTHIL S,RAO K S,NAGINI S.Altered cytokeratin expression during chemoprevention of experimental hamster buccal pouch carcinogenesis by garlic [J].J Oral Pathol Med ,2002,31(3):142.

[8] 李岩，王美惠，吴素琴，等.黑大蒜提物对高脂血症大鼠血脂的作用、抗氧化活性及对免疫功能的影响[J].内蒙古民族大学学报(自然科学版)，2014(2)：193-197.

[9] 王家埔,于克学,高翠希.大蒜油提取与应用研究现状[J].保鲜与加工,2002,2(4):11-12.

[10] 晃芳芳,李森.大蒜油不同加工工艺的比较[J].西北粮油科技,2003(4):47-48.

[11] 陈海魁.大蒜素提取工艺的研究[J].安徽农业科学，2014(30)：10637-10639.

[12] 张民,张倩娟,刘玉柱,等.HPLC法测定大蒜中蒜氨酸和大蒜素的含量[J].食品与发酵工业，2009,35(2):156-158.

Detection of Allicin Content in Garlics by High Performance Liquid Chromatography

HAN Gui-zhi,WANG Wen-jun,WANG Fang

(School of Public Health，Jining Medical College,Jining,Shandong 272013)

Key wordsEthanol; Ethyl acetate; Allicin; Extraction time optimization

Abstract[Objective] To establish an analytical method to detect the content of allicin in garlics based on the optimization of extractant selection,dosage and extraction time.[Method] After comminution and enzymolysis of garlics,ethanol and ethyl acetate were used as the extractants to prepare allicin solution.Allicin content was analyzed by high performance liquid chromatograph,so as to determine the optimal extractants.By comparing the extracts detection of different periods,the optimal extraction time was obtained.[Result] The average concentration of allicin reached 28.85 μg/mL with ethanol as the extractant; and the average concentration of allicin was 13.24 μg/mL in ethyl acetate extraction group.Based on comparison,the optimal extraction time was 3.0 h for the extraction of allicin by ethanol.[Conclusion] As a commonly used laboratory chemical reagent,ethanol had the advantages of low toxicity,no pollution and high efficiency.This research provides references for the development and utilization of allicin extraction in laboratory for medicine and food.

基金项目济宁市科技局项目(2013jnwk74)。

作者简介韩贵芝(1986- ),女，山东临沂人，助理实验师，硕士，从事食品毒理研究。 *通讯作者，副教授，从事公共卫生方面研究。

收稿日期2016-01-04

中图分类号S 41-33

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)07-057-02