王延辉，师邱毅，孙金才，杨宸笑

(1.浙江医药高等专科学校，浙江宁波 315100；2.浙江医药高等专科学校功能食品研究所，浙江宁波 315100)



胡椒梗中挥发性成分提取及其抑菌效果研究

王延辉1，2，师邱毅1，2，孙金才1，杨宸笑1

(1.浙江医药高等专科学校，浙江宁波 315100；2.浙江医药高等专科学校功能食品研究所，浙江宁波 315100)

摘要[目的]提取并分析胡椒果梗和胡椒果中的挥发性化合物成分及其抑菌效果。[方法] 联合采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和同时蒸馏萃取(SDE)提取胡椒果梗和胡椒果中的挥发性化合物，利用气质联用对提取的挥发性成分进行定性和相对定量分析；采用滤纸片抑菌圈法测定胡椒梗挥发油抑菌效果。[结果] 试验显示，胡椒梗共分离鉴定出α-香芹烯27.23%、β-月桂烯8.48%、α-蒎烯8.32%、莰烯7.77%、α-柠檬醛7.68%、松油醇7.52%、α-石竹烯4.99%等85种化合物，胡椒梗与胡椒中的挥发性成分无明显差异；其提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制能力无明显差异。[结论] 研究可为胡椒果梗的综合利用提供理论数据和技术支持。

关键词气相色谱质谱联用；胡椒梗；挥发油；抑菌

胡椒(PipernigrumL.)属胡椒目胡椒科，为胡椒科植物胡椒的果实，又名浮椒、玉椒，主要用于西式食品的调味，其加工品胡椒油于2003年列入食品添加剂国家标准。胡椒温中，下气，消痰，解毒，可治寒痰食积，脘腹冷痛，反胃，呕吐等，同时具有“热带香料之王”的称号。近年来的研究表明，胡椒在镇痛、抗炎、抗惊厥、杀虫、抗癌、抗氧化、抑菌等多方面具有活性[1-6]。

国内针对胡椒的研究主要集中在胡椒的种植、胡椒及胡椒粉的加工、胡椒油的生产以及胡椒初加工机械的研制与开发等方面[7-13]。其中胡椒油的生产已具有相当大的规模，但在胡椒油生产过程中存在的大量胡椒梗则主要做为废料处理，对环境造成一定的污染和资源浪费。因此笔者联合采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和同时蒸馏萃取提取(SDE)分析胡椒梗和胡椒中的挥发性化合物成分，利用气相色谱-质谱(GC-MS)分离并鉴定其主要成分，并对挥发油的抑菌效果进行了初步研究，以期为胡椒果梗的综合利用提供理论数据和技术支持。

1材料与方法

1.1材料新鲜青胡椒果采集于海南某胡椒种植基地，冰温运输至实验室，聚乙烯袋分装密封后置于4 ℃环境保存，果梗分离后分别液氮粉碎预冷，冷冻干燥后低温保存备用。

金黄色葡萄球菌(Staphlococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)，广东省微生物菌种保藏中心；石油醚，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；正己烷，色谱纯，赛默飞(美国)；SDE同时蒸馏装置，自制；LABOROTA 4000旋转蒸发仪，海道夫(德国)；QGC-121氮吹仪，泉岛。

1.2方法

1.2.1挥发油及固相微萃取提取。顶空挥发性成分提取条件：准确称取1.0 g冻干粉于顶空样品瓶中，立即封口，金属浴60 ℃平衡40 min，将65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取头(Supelco，USA)插入顶空样品瓶吸附30 min，进样口5 min解析，然后进行气相分析。气相条件：进样口温度250 ℃，不分流进样；Trace1300-ISQ(Thermo fisher，USA)，30 m×0.25 mm×0.25 μm TR-5MS色谱柱；初温40 ℃，保留3 min，5 ℃/min上升到100 ℃，保留5 min，4 ℃/min上升到250 ℃，保留10 min。质谱条件：传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，EI源电压70 eV。

同时蒸馏萃取提取条件：称取50 g(精确到0.1 g)样品，放入500 mL的圆底烧瓶中，加入200 mL超纯水，加入少量玻璃珠。接收端接预装90 mL沸程90～120 ℃石油醚的250 mL圆底烧瓶内，85 ℃恒温水浴提取60 min。萃取结束上层有机相过50 g无水硫酸钠柱脱除水分。滤液经旋转蒸发仪浓缩近干，加1 mL色谱纯正己烷转移至样品瓶。气相条件：进样口温度250 ℃，分流进样，分流比1∶50；Trace1300-ISQ(Thermo Fisher，USA)，30 m×0.25 mm×0.25 μm TR-5MS色谱柱；初温60 ℃，保留3 min，5 ℃/min上升到100 ℃，保留5 min，4 ℃/min上升到250 ℃，保留10 min。质谱条件：传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，EI源电压70 eV。1.2.2萃取前处理。样品萃取前，萃取头须按照说明书在进样口老化。以挥发性化合物总色谱峰面积和种类为指标，比较分析了萃取头类型、样品平衡时间、萃取时间、解析时间等对挥发性化合物的提取效果。

1.2.3挥发油抑菌效果测定。将直径为6 mm的圆形定性滤纸片经160 ℃ 2 h干热灭菌后，置于不同浓度的胡椒和胡椒梗挥发油中浸渍4 h，之后滤纸片无菌干燥备用。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活化并调整好菌液浓度，取菌悬液0.1 mL加到PCA(平板计数琼脂)培养基上并涂布均匀。取浸有挥发油的滤纸片贴在含菌培养基平板上，每块平板平行做3片，每种菌平行做3块平板。同时做提取溶剂(石油醚)阴性对照，青霉素G为阳性对照。置培养箱中37 ℃恒温培养24 h。采用迅数CzoneG6T菌落计数仪测定抑菌圈直径，结果取3次重复试验的平均值。

1.3数据处理挥发性化合物鉴定采用Thermo Fisher Main lib和NIST11 谱库检索，保留指数定性，结合已有参考文献进行人工解析确认，面积归一化法进行挥发性化合物的定量分析。

2结果与分析

2.1SPME萃取条件的选择及萃取结果分析比较了50/30 μm PDMS/CAR/DVB、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 3种固相微萃取萃取头在60 ℃金属浴恒温平衡1 h的

萃取效果，挥发性化合物的峰面积和挥发性化合物的种类如图1所示。可以看出，50/30 μm PDMS/CAR/DVB分离出140个色谱峰，总离子峰面积5.64×109，其提取的挥发性化合物种类和含量都优于65 μm PDMS/DVB和75 μm CAR/PDMS萃取头，因此采用50/30 μm PDMS/CAR/DVB萃取头进行试验。

同时也对比研究了平衡温度和平衡时间对萃取效果的影响，结果如图2所示。随着萃取温度的增加，挥发性化合物的总离子流峰面积逐渐增加，同时水蒸气易吸附于萃取头上，影响萃取效果，因此设定萃取温度60 ℃。60 ℃萃取20～80 min，发现40 min后达到峰值，纤维萃取头涂层较薄，容易饱和，之后所萃取的含量有所下降，因此设定萃取时间40 min。

采用50/30 μm PDMS/CAR/DVB 萃取头提取并GC-MS进样口热解析后，经NIST谱图检索并与相关文献比对，面积归一化法测定挥发性组分的相对百分含量，胡椒梗中检出并确定出59种挥发性化合物，胡椒中检出55种挥发性化合物，具体见图3和表1。胡椒梗中萜类48种，含量97.35%；酚类1种，含量0.01%；醛类5种，含量0.12%；烯醇类3种，含量0.07；酯类1种，含量0.09%；其他类，1种。胡椒中萜类48种，含量98.77%；酚类1种，含量0.01%；醛类3种，含量0.07%；烯醇类2种，含量0.13%；酯类1种，含量0.05%。

胡椒梗和胡椒挥发性化合物中萜类的主要成分为d-香芹烯(d-Limonene)、β-松油烯(β-Terpinene)、桉叶油醇(Cineole)、d-α-蒎烯(d-α-Pinene)、β-蒎烯(β-Pinene)、α-柠檬醛(α-Citral)、β-月桂烯(β-Myrcene)、β-柠檬醛(β-Citral)、(+)-香茅醛(6-Octenal，3，7-dimethyl-，(R)-)、β-石竹烯(β-Caryophyllen)、莰烯(Camphene)、松油醇(Terpineol)、水芹烯(Phellandrene)、罗勒烯(Ocimene)、β-榄香烯(β-Elemen)、芫荽醇(Linalol)、3-侧柏烯(3-Thujene)、d-大根香叶烯(D-Germacrene)。

2.2水蒸气同时蒸馏提取条件下胡椒梗与胡椒挥发性化合物对比水蒸气同时蒸馏萃取胡椒梗和胡椒中的挥发油，总离子流色谱图见图4，挥发性化合物鉴定结果见表2。经GC-MS分离鉴定，胡椒梗中检出并确定54种挥发性化合物，胡椒中检出50种挥发性化合物。胡椒梗中萜类50种，含量86.01%；醇类2种，含量0.02%。胡椒中萜类48种，含量75.45%；醇类2种，含量0.11%。

在胡椒萜类中主要发挥发性化合物为α-松油醇(α-Terpineol)、反式-松香芹醇(trans-Carveol)、α-环氧蒎烷(α-Pinene oxide)、榄香烯(Elemene)、异戊酸香叶酯(Geranyl isovalerate)、喇叭茶醇(Ledol)、柠檬醛(Citral)、β-柠檬醛(β-Citral)、桉树醇(Eucalyptol)、L-松油醇(L-Terpineol)、(+)-香茅醛((R)-(+)-Citronellal)、D-柠檬烯(D-Limonene)、石竹烯(Caryophyllene)、芫荽醇(Linalool)、松油烯-4-醇(Terpinen-4-ol)、β-榄香烯(β-Elemene)、β-松油烯(β-Terpinene)、石竹烯氧化物(Caryophyllene oxide)、左旋-β-蒎烯((1S)-(1)-β-Pinene)、香茅醇(Citronellol)、β-蒎烯(β-Pinene)、香叶醇(Geraniol)、顺马鞭草烯醇(cis-Verbenol)、松油醇(Terpineol)、cis-香叶醇(cis-Geraniol)。

2.3抑菌效果采用滤纸片法测量了胡椒及胡椒梗挥发油的抑菌作用，由表3可见，胡椒与胡椒梗挥发油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径相差不大，在抑制这2种菌

种方面没有明显区别。

表3胡椒及胡椒梗挥发油抑菌效果

Table 3Antibacterial effects of volatile oils inP.nigrumandP.nigrumstalks

3讨论

通过使用SPME和SDE提取方法，胡椒梗和胡椒中共确认出85种挥发性成分，其中30种属于共同检出成分，均属于萜类物质，含量较高的是d-香芹烯(D-Limonene)、β-松油烯(β-Terpinene)、桉树醇(Cineole)、D-α-蒎烯(D-α-Pinene)、β-蒎烯(β-Pinene)、β-柠檬醛(β-Citral)、(+)-香茅醛(((R)-(+)-Citronellal))、β-石竹烯(β-Caryophyllen)、莰烯(Camphene)、松油醇(Terpineol)、水芹烯(Phellandrene)、罗勒烯(Ocimene)、β-榄香烯(β-Elemen)，这些成分在白胡椒粉、山胡椒叶、黑胡椒等都有分离鉴定出，为关键的挥发油成分[14-19]。因此，可以有效利用胡椒梗提取挥发油用来生产胡椒油食品添加剂，同时胡椒梗挥发油具有胡椒类似的抑菌抗氧化效果，也可以作为防腐剂使用。

参考文献

[1] 陈文学，胡月英，葛畅，等.黑胡椒抑菌活性物质提取工艺优化[J].食品工业科技，2010(11)：279-282.

[2] 侯冬岩，回瑞华，李铁纯，等.黑胡椒根萜类化合物的分析[J].分析试验室，2004，23(9)：19-21.

[3] 徐燕，刘德清.胡椒中天然防腐剂的提取方法及其抑菌作用研究[J].中国调味品，2007(7)：57-60.

[4] 何瑞琪，魏素红，郭善广，等.白胡椒和肉桂对冰鲜鸡的保鲜效果研究[J].肉类研究，2010(5)：43-46.

[5] 童汉清，吴景雄，李田，等.胡椒油的抗氧化性研究[J].中国调味品，2008(10)：52-55.

[6] 刘蒙佳，周强，林海虹.三种天然香辛料液对冷却肉保鲜效果的研究[J].肉类工业，2013(11)：43-48.

[7] 葛畅，李玉林，张园，等.胡椒初加工机械研究进展[J].农机化研究，2014，36(10)：261-264.

[8] 李明.我国胡椒初加工的现状与分析[J].广西热带农业，2004(1)：37-39.

[9] 杨建峰，邬华松，孙燕，等.我国胡椒产业现状及发展对策[J].热带农业科学，2010，30(3)：52-55.

[10] 刘红，欧仕益，王庆煌，等.脱水青胡椒粉风味成分的研究[J].中国农学通报，2012，28(30)：283-288.

[11] 刘立鼎，顾静文，陈京达.山胡椒叶子化学成分及其应用[J].江西科学，1992，10(1)：38-44.

[12] 潘晓军，林观样，王贤亲，等.浙产山胡椒根挥发油化学成分的研究[J].光谱实验室，2010，27(5)：1777-1779.

[13] 罗烈武，夏贤明.胡椒综合利用的探讨[J].科研与设计，1993(2)：16-18.

[14] 郭墨亭，黄雪松.胡椒幼果与黑、白胡椒香气成分的比较研究[J].食品工业科技，2012，33(15)：93-95.

[15] 郑品梅，邹纲明，李彦威.胡椒油的研究进展[J].食品科技，2007，32(1)：25-28.

[16] 张水平，谷风林，吴桂苹，等.胡椒果与胡椒叶精油化学成分分析[J].热带作物学报，2014，35(2)：387-395.

[17] 丁成翠，徐志，章程辉，等.脱水与冷冻干燥青胡椒挥发油中化学成分的 GC-MS 分析[J].食品科学，2012，33(4)：196-199.

[18] 李祖光，乔剑峰，胡伟，等.固相微萃取-气相色谱/质谱法分析白胡椒粉的风味成分[J].理化检验(化学分册)，2006，41(11)：820-822.

[19] 谭乐和，赵建平，刘红，等.不同加工方法对胡椒精油化学成分的影响[J].热带作物学报，2009(3)：382-385.

Extraction of Volatile Components fromPipernigrumL. Stalk and Their Antibacterial Effects

WANG Yan-hui1,2, SHI Qiu-yi1,2, SUN Jin-cai1et al

(1. Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo, Zhejiang 315100; 2. Functional Food Research Institute of Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo, Zhejiang 315100)

Key wordsGas Chromatograph Mass Spectrometer (GCMS);P.nigrumstalks; Volatile oil; Bacteriostasis

Abstract[Objective] To extract and analyze the volatile compounds and antibacterial effects ofPipernigrumL. stalks and fruits. [Method] Volatile compounds were extracted fromP.nigrumstalks and fruits by HS-SPME and SDE. Qualitative and relative quantitative analysis of volatile components was carried out by GC-MS. Antibacterial effects of essential oil inP.nigrumstalks were detected by filter paper inhibition zone method. [Result] d-limonene(27.23%), β-myrcene (8.48%), α-pinene (8.32%), camphene(7.77%), α-citral(7.68%), terpineol(7.52%) and caryophyllene (4.99%) were the major components of the 89 identified volatile compounds in theP.nigrumstalk. Volatile components ofP.nigrumandP.nigrumstalks had no significant differences. Inhibiting ability of extracts had no significant differences between Staphylococcus aureus and Escherichia coli. [Conclusion] This research provides theoretical data and technical support for the comprehensive utilization ofP.nigrumstalks.

基金项目浙江省教育厅高校科研项目(Y201320218)；浙江医药高等专科学校科研项目(ZPCSR2013008)；慈溪市科技计划项目(CN2014019)；宁波科技富民项目(201501CX-D01021)。

作者简介王延辉(1982-)，男，河南许昌人，讲师，硕士，从事食品科学研究。

收稿日期2016-01-26

中图分类号S 573+.9

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)07-052-05