于颖彦



我国胃肠道肿瘤生物样本库建设与发展15年回顾*

于颖彦

摘要肿瘤生物样本库是转化医学研究与精准医学研究的重要基础设施，在欧美等国家倍受重视。纵观我国胃肠道肿瘤生物样本库建设与发展走过的15年历程，在样本库建设形式上经历了最早的项目驱动性科室建设模式，发展到区域生物样本库网络融合模式，再到即将纳入国家重大基础研究设施建设规划模式。在样本库建设内容上，从最初仅收集患者外周血与肿瘤组织模式，至患者体液（血液与尿液）、组织及临床病理学信息同步收集与信息化管理模式。高质量的肿瘤生物样本是支撑我国胃肠道肿瘤研究领域开展国内或者国际重大合作研究项目的材料与信息资源保障。本文详尽介绍了我国胃肠道肿瘤生物样本库建设15年来的经验与存在问题，尤其对研究人员关心的长期低温冻存肿瘤组织生物样本的质量控制问题进行了介绍。

关键词胃肠道肿瘤生物样本库质量控制

*本文课题受国家高技术研究发展计划（863计划）（编号：2012AA02A504，2012AA02A203）、国家自然科学基金项目（编号：81172329，81372644）、上海交通大学医学院转化医学创新基金（编号：15ZH1002，15ZH4001）和上海交通大学医学院“985”工程建设生物样本建设基金资助

Retrospect of 15-year construction and progress of biobank for gastrointestinal cancer in China

Yingyan YU
Correspondence to: Yingyan YU; E-mail: ruijinhospitalyyy@163.com
Department of Surgery, Shanghai Ruijin Hospital, Shanghai Institute of Digestive Surgery, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China

This work was supported by the Chinese National High Tech Program (No. 2012AA02A504, 2012AA02A203), the National Natural Science Foundation of China (No. 81172329 and 81372644), the Innovation Foundation of Translational Medicine of Shanghai Jiaotong University School of Medicine (No. 15ZH1002 and 15ZH4001), and "985" Project of Biobank of Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Abstract Tumor biobank is a critical infrastructure for translational medicine research and precise medical research, which has been paid increasing attention in Western countries. Three different periods exist throughout the course of the 15-year construction and progress of the gastrointestinal cancer biobank in China. The periods include the following: construction of a project-driven biobank, which is closely related to the division's project; formation of a regional network of biobanks, which integrates multiple biobanks with different kinds of diseases; and enrollment of the project to national key basic research facilities by the government. The constructioncontent of gastrointestinal cancer biobank has two stages: collection of peripheral blood and tumor tissues, patient body fluids (blood and urine), and tumor tissues; and information management of clinical and pathological details. The high-quality biospecimens safeguard the strong support of many domestic projects and international research projects. This review summarizes the experiences and problems of gastrointestinal tumor biobanks in China. The author introduces quality control problems for long-term cryopreserved biospecimens in deep freezer.

Keywords:gastrointestinal cancer, biobank, quality control

肿瘤生物样本库顾名思义就是为了医药研究的需要而收集、储存和分配肿瘤样本的机构。自20世纪末肿瘤转化医学研究理念提出以来，各国研究人员、临床医师以及药物研发企业均十分重视生物样本库的建设。我国在该领域起步并不算晚，并且从“十一五”到“十二五”期间均得到了国家科技部以及地方政府资金的投入。鉴于肿瘤转化医学与精准医学研究都需要高质量肿瘤生物样本的支撑，笔者结合多年在胃肠道肿瘤生物样本库建设的实践经验，对该领域大家普遍关心的问题做一阐述。

1　国内外肿瘤生物样本库的形式

当前，国内外陆续建立了不少肿瘤样本库，形式多种多样。有国家集约化管理的，如英国国家生物样本库（UK Biobank）与德国国家研究队列（German National Cohort）［1-2］，也有各单位因科研项目需要自行建设的。依据笔者从事胃肠道肿瘤生物样本库建设与管理多年经验和对国际大型生物样本库实地走访所见所闻，一般集约化管理的生物样本库往往适用于仅收集血液或其他体液样本，因为血液与体液样本的收集具有便于集中采集、集中分装、集中入库储存等优势；而肿瘤组织样本的采集与分装很难实现集约化收集模式，更多的是依赖于外科手术医师与病理取材医师的参与和密切合作，才能实现在肿瘤手术切除后的离体短时间内（通常在30 min）获取到新鲜肿瘤组织以及配套的正常对照样本。众所周知，国内外传统医疗档案中已经储存了相当一部分肿瘤组织样本，但这些样本都是经过福尔马林固定、石蜡包埋的组织块，几乎很难用这些组织进行现代基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等“组学”研究，建设肿瘤生物样本库的需求日益高涨，在此种情况下便逐步诞生了生物样本库。因此，肿瘤生物样本库建设是科学发展需求，更是时代发展需求的产物。

2　我国胃肠道肿瘤生物样本库发展的三阶段模式

纵观我国胃肠道肿瘤生物样本库发展历程大致分成以下3个阶段：1）项目驱动建设阶段。即广大临床一线从事肿瘤的研究人员出于本单位或者本学科科研项目的需要，自发地收集新鲜肿瘤组织样本阶段。20世纪末至21世纪初，分子生物学不断向临床肿瘤研究领域渗透，一些检测mRNA表达的PCR实验、检测蛋白质表达的Western blot实验、检测基因表达谱的基因芯片实验等均需要新鲜组织样本才能够实现。在众多科研项目驱动下，临床研究人员特别是肿瘤外科界的研究人员纷纷建立起本学科的胃肠道肿瘤生物样本库。如北京大学肿瘤医院以季加孚教授为首建立的胃肠道肿瘤生物样本库、上海交通大学医学院附属瑞金医院以朱正纲教授为首建立的胃肠道肿瘤生物样本库都是在那个年代应运而生，该阶段经历了10年左右［3-5］。胃肠道肿瘤生物样本库建设的初衷是希望在胃肠道肿瘤患者的血清或者组织中寻找新型诊断标志物以及药物治疗靶标，故一般的建设内容中均包括留取手术前患者的外周血，收集到的外周血应当在5 h内进行离心处理，然后分装到低温冻存管内低温冻存；再将手术切除的样本在离体30 min内切取部分正常黏膜组织和部分肿瘤组织，剪成小指甲片大小分装到低温冻存管内低温冻存。近几年为了便于后续开展尿液代谢组学研究，在胃肠道肿瘤生物样本库建设中有些生物样本库又增加收集患者术前中段尿液的内容，收集到的尿液同样需要在5 h内进行离心分装到冻存管内，然后置低温冰箱冻存。在上述生物样本储存方面，患者体液样本可以在-40℃至-80℃低温冰箱保存，而胃肠道肿瘤组织样本则务必在-80℃低温冰箱保存，有条件的单位还应当考虑同时在液氮中保存部分肿瘤组织样本。在胃肠道肿瘤生物样本库建设中务必同时收集详尽的患者临床病理学信息，并定期随访患者术后治疗经过与临床结局，做好生物样本库的信息化建设与管理。2）胃肠道肿瘤生物样本库整合到区域生物样本库网络阶段。随着各个系统疾病研究对新鲜样本的需求与日俱增，加之转化医学研究理念在国内日益受到重视，我国的肿瘤生物样本库建设逐步引起各级科研主管部门、生物医药相关企业或者行业协会的重视。国内逐步出现以单位行为或者行业协会形式发起组建的多学科生物样本库网络，如上海肿瘤医院多肿瘤生物样本库、上海交通大学医学院“985”工程建设生物样本库网、中国医药生物技术协会生物样本库分会等。这一时期的肿瘤生物样本库不再是以单纯满足某一学科的自给自足为目的，而是更加强调生物样本的共享、生物样本对国家级或者国际性重大项目的贡献、生物样本收集的规范性、生物样本库数据的信息化管理程度等。如郜恒骏教授组织的中国医药生物技术协会生物样本库分会不仅召开样本库建设学术交流会议，还着手制定生物样本收集标准流程（SOP）并在会员单位普及推广［6］；吕有勇教授负责的国家“863”《胃癌分子分型与个体化诊疗》项目制定了各参与单位统一的生物样本收集与临床病理学信息收集规范［7］；上海交通大学医学院资助旗下数家大型附属医院建立多病种生物样本库，并推进实现了样本库的信息化建设与网络化管理。经过大约5年的样本库区域网络化建设，加之前10年左右的生物样本库基础性建设，不仅是胃肠道肿瘤生物样本库，我国整体肿瘤生物样本库及相应的临床病理学信息建设均得到长足的发展，对我国肿瘤基因组研究较早地跨入国际第一方阵起到了决定性作用。通过文献检索不难发现，自2010年至2015年期间，我国肿瘤界科研人员在国际刊物上连续发表肿瘤基因组研究相关成果，并代表中国参与了国际癌症基因组联盟（ICGC）重大国际项目就是最好的见证［8-18］。3）生物样本库建设纳入国家重大基础研究设施阶段。进入2015年，医学研究由转化医学研究跨入精准医学研究时代，国家科技主管部门意识到肿瘤生物样本库已经不是可有可无的附属设施，应当作为国家重大基础研究设施加以建设。以上海瑞金医院正在筹建的转化医学（上海）国家重大科技基础设施为例，预计完工后将包含一个国际一流的大型多病种生物样本库［19］。可以预见，未来的精准医学研究以及转化医学研究对高质量的生物样本的需求会越来越大。

3　肿瘤生物样本库发展过程中遇到的问题

胃肠道肿瘤生物样本库的建设与发展走过的15年是我国实体瘤生物样本库建设的缩影。经过15年的建设，低温冻存的肿瘤生物样本数量不断增加。15年来，广大肿瘤研究人员靠着这批高质量生物样本产出了一批高质量的研究成果，肿瘤生物样本库支撑了多项国家级与国际性重大研究项目。但随着时间推移，人们不免会产生如下担忧：肿瘤生物样本在低温储存下究竟能够存放多少年；各种“组学”研究需要的核糖核酸或者蛋白质大分子是否会因低温保存时间太长而影响检测结果；生物样本是需要无限制地储存下去，还是存储到一定年限即行销毁。这些都是摆在生物样本库建设者、管理者与样本使用者面前的实际问题。这些问题不是哪位权威、专家、样本库管理者可以决定，而是需要切实的生物样本质量控制研究数据来回答。笔者所在单位是国内最早开始收集胃肠道肿瘤生物样本的单位之一，笔者参与了大量工作，可以说比任何人都想知道以上问题的答案。本研究组曾经在生物样本收集满5年时随机抽取过一批胃癌组织样本进行核酸与蛋白质的质量分析。由于受到样本库管理经验、生物样本检测方法学技术的发展等多因素制约，当时仅用BCA法测定了蛋白浓度，用凝胶电泳法鉴定了RNA 与DNA的完整性，并针对原癌基因NF-κB检测了单核苷酸多态性（SNP）的位点变异、mRNA与蛋白质的表达水平。通过前期对低温冻存5年以内胃癌样本的质量检测，我们初步断定，低温冻存5年的样本其DNA分子完整性与质量均未受影响；储存3年或以上的标本与保存1～2年者相比，NF-κB基因的mRNA表达及蛋白质表达均有所下调［20］。如今随着岁月推移，不少生物样本库中的样本储存已达10年或者更久，在此期间，分子生物学界对生物大分子质量检测的方法学有了长足的发展，适时的将这些分析方法应用于胃肠道肿瘤生物样本库的质量控制研究，将有助于回答人们对生物样本质量所关注的诸多问题。在胃肠道肿瘤分子生物学研究中，科研人员最为关注的就是DNA、RNA与蛋白质的质量是否可以确保实验顺利实施。现根据国内外生物大分子质量检测技术的发展与本实验室经验做一系统性介绍。

3.1低温冻存样本的DNA质量评估

DNA是生物大分子中最为稳定的分子，往往可以耐受长时间的储存甚至高温处理，有些年代久远的考古样本鉴定都是通过DNA分子进行的。生物样本的DNA质量控制分析时除了关注分子完整性外（1%凝胶电泳中的DNA条带是否明亮清晰），还要关注OD260/OD280的吸光度比值。OD260代表核酸DNA的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度。植物样本分析，还要关注OD230值（代表多糖类），但由于人类组织多糖类残留的可能性比较低，故可以不去关注OD230值。纯净的DNA其OD260/OD280≈1.8，若比值>1.9表明有RNA污染，根据情况可考虑用RNA酶进行纯化；若OD260/OD280比值<1.6，表明有蛋白质或酚等试剂污染，也可根据情况进行相应的纯化。

3.2低温冻存样本的RNA质量评估

RNA是生物大分子中稳定性较差的分子，比较容易降解。分子生物学实验需要明确生物样本RNA分子的完整性。以往对于RNA的质量控制分析一直沿用1%凝胶电泳中观察RNA条带，通过观察琼脂糖凝胶电泳图的28S与18S核糖体RNA（rRNA）条带的存在与否与条带亮度，计算28S和18S rRNA条带的比值，当比值为2则认为RNA分子完整［21-23］。自从安捷伦公司开发出生物分析仪后（Agilent 2100生物分析仪），人们很快注意到，借助于安捷伦生物分析仪不仅可以得到规范清晰的色谱图像，便于观察28S与18S RNA的分布情况，最为有用的是，该仪器自带分析软件（RIN software algorithm）可以给出检测样本的RNA完整性数值（RNA integrity number，RIN）。RIN采用1～10的数字表示，完整RNA分子的RIN为10。根据已经发表的对生物样本质量评估报道来看，RIN值高于7可以视为RNA分子质量优秀，适用于较高级别的RNA研究，如基因芯片检测；RIN值为4~7视为RNA分子质量良好，可用于一般级别的定量PCR研究；当RIN值在4以下或者接近1时提示RNA分子降解严重，已经不适合进行RNA水平的研究［24］。安捷伦生物分析仪问世以来，以其独特的优势受到业界广泛关注与好评。然而，由于该检测设备较为昂贵，目前主要在大型基因芯片检测公司或者测序公司有配备，尚未在一般实验室普及。

3.3低温冻存样本的蛋白质质量评估

蛋白质是基因表达的终产物，其分子的稳定性众说纷纭。以往均认为蛋白质需要低温保存，加热可导致蛋白质不可逆性变性而失去原有的抗原性。但20世纪90年代以来，一种微波加热修复抗原技术（antigen retrieval）问世，该项技术可以使保存数十年之久的石蜡包埋组织蛋白质抗原性得以恢复，再通过免疫组织化学技术实现蛋白质表达的检测。该项技术的基本原理是利用高温或者强碱打开甲醛与蛋白质之间的交联结构，实现组织蛋白质的暴露与检测［25］。伴随着这一免疫组织化学技术的革命性突破，对蛋白质分子的稳定性与抗原性也应当重新思考。虽然免疫组织化学工作者未对抗原修复的具体机制、热修复前后的蛋白质结构给予更加深入细致的研究，但这一不争的事实至少可以提醒科研人员，蛋白质具有极强的耐热能力，高温加热处理并未消除蛋白质的抗原性。最近，科研人员不断探索利用福尔马林固定、石蜡包埋的组织块提取蛋白质进行蛋白质组学研究甚至进行Western blot分析。从现有发表的研究结果看，在肿瘤研究领域已经发现了差异蛋白质谱，但差异蛋白分子量往往在50 kD以下［26］，这些成果已经为今后研究人员针对医疗档案中丰富的石蜡包埋组织块提供了良好的参考。目前，对组织样本库中或者石蜡包埋组织块中的蛋白质分子进行质量评估还需要开展系统性研究。能够从文献检索到的生物样本质量评估文章大多限于DNA与RNA层面。一般实验室采用BCA法检测样本的蛋白含量，但无法评估蛋白质分子的完整性。最近，本实验室在与北京大学肿瘤医院开展学术探讨以及查阅文献中受到启发，开始探索将考马斯亮蓝染色法（coo⁃ massie brilliant blue，CBB）引入蛋白质分子的完整性评估。CBB法利用了蛋白质具有与染料结合的能力，不仅可以定量测定蛋白的浓度，还能够在染料染色后的聚丙烯酰胺凝胶上显示清晰的不同分子量蛋白质条带［27-30］。考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中能够与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由465 nm变为595 nm，染色溶液由棕黑色变为蓝色。通过测定595 nm处吸光度值可测定其结合蛋白质的含量，CBB法在一些实验室也用来进行蛋白质定量检测［30］。鉴于CBB法是根据凝胶上清晰显示蛋白质条带这一特性，同样可以将其用于蛋白质分子的完整性评判。基于这一原理，本研究室最近已经将CBB法用于胃癌生物样本的蛋白质完整性评估并取得了预期成果。我们发现，随着低温冻存时间延长，在CBB凝胶染色检测中蛋白质条带数目减少、条带清晰度以及大分子量条带数目明显减少甚至消失。相信这些探索性的研究发现对胃肠道肿瘤生物样本库建设、对其他实体瘤生物样本库的建立与管理均会起到重要借鉴作用。

4　展望

在精准医学时代，肿瘤生物样本的作用越发重要。鉴于人群的生物多样性，今后生物样本库建设可能会从重视样本的数量转向生物样本的多样性，暨收集到的样本类型应当更加广泛与多样。在生物样本储存条件上将更加强调安全性，如是否有断电保护措施、是否具备防火防洪措施、珍稀样本的第三方储存机制可能会得到考虑。此外，大型研究项目与企业药物研发等对高质量生物样本的需求增加，生物样本与信息的共享机制将会提到议事日程。由于国内各大型样本库前期均是由国家或者地方政府项目基金支持所建，生物样本收集与管理人员投入了大量的人力与物力，对于第三方或者有赢利性质的企业希望样本共享目前尚难以实现。因此，生物样本库建设方与使用方需要通过商谈建立各方均可接受的生物样本与临床病理学信息共享机制。如签署共同署名或者共同持有知识产权协议、企业以研究立项形式对生物样本库建设方给予资金上的投入与支持等。最为重要的是，由于生物样本的稀有性与不可复制性，低温冻存并非是一劳永逸之举，考虑到生物大分子的完整性会随着时间推移而受到破坏，故如何有组织、有规划、有目的地充分利用现有生物样本库库存样本，以期最大化产出推动精准医疗发展的研究成果至关重要。

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（2015-11-30收稿）

（2015-12-22修回）

（编辑：邢颖）

·专家论坛·

梁寒，教授，主任医师，现任天津医科大学肿瘤医院胃部肿瘤科科主任。中国抗癌协会理事，天津抗癌协会理事，中国医师协会肿瘤外科分会副主任委员，中国抗癌协会胃癌专业委员会副主任委员，中华医学会肿瘤学会胃肠学组副组长，中国临床肿瘤学会中国肿瘤驱动基因分析联盟（CAGC）执行委员会常委，中国研究型医院消化道肿瘤专业委员会常委，中国临床肿瘤学会胃肠道间质瘤专家委员会委员，卫生部全国肿瘤规范化诊治专家委员会委员，天津市抗癌协会胃癌专业委员会主任委员，天津市中西医结合外科学会副主任委员，《Journal Gastroenterology and Hepatology》、《中华胃肠外科杂志》、《中国肿瘤临床》、《中华肿瘤防治杂志》、《消化肿瘤杂志》、《中国普外基础与临床杂志》编委。出版专著6部，发表论文300余篇，其中SCI收录论文50余篇。

通信作者：于颖彦ruijinhospitalyyy@163.com

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.01.075

作者单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院上海消化外科研究所，上海市胃肿瘤诊治重点实验室（上海市200025）