秦 干，徐亚运，程江群，葛金芳

◇药学研究◇

白藜芦醇改善亚临床甲状腺功能减退症大鼠的学习记忆能力及其可能机制

秦 干，徐亚运，程江群，葛金芳

目的观察白藜芦醇（RES）对亚临床甲状腺功能减退（SCH）大鼠学习记忆能力的影响并探讨其可能机制。方法雄性成年SD大鼠，单侧甲状腺电凝毁损术建立SCH大鼠模型，随机分为模型组、RES（15 mg/kg）组及左旋甲状腺激素（LT4，60μg/kg）组，同时设假手术组，每组8只。灌胃给药2周后采用Morris水迷宫和Y迷宫观察大鼠学习记忆能力，放射免疫分析法检测大鼠血浆促甲状腺素（TSH）、游离甲状腺素（fT4）和三碘甲腺原氨酸（T3）浓度，Real-time PCR和Western blot方法观察大鼠海马中脑源性神经营养因子（BDNF）的表达。结果与假手术组比较，SCH大鼠血浆TSH浓度显著上升而T3和fT4浓度无明显改变，LT4（60 μg/kg）和RES（15 mg/kg）灌胃给药均可降低SCH大鼠升高的TSH浓度但LT4组大鼠血浆fT4浓度也显著上升。与假手术组比较，SCH大鼠在Morris水迷宫和Y迷宫中的学习记忆能力显著下降，并且海马BDNF的mRNA及蛋白表达水平均显著降低。LT4（60μg/kg）和RES（15 mg/kg）灌胃给药2周可逆转SCH大鼠受损的行为学表现并增加BDNF在海马的表达。结论RES可改善SCH大鼠的学习记忆能力，其机制与调控SCH大鼠失衡的甲状腺功能及海马BDNF表达有关。

白藜芦醇；亚临床甲状腺功能减退；Morris水迷宫；Y迷宫；脑源性神经营养因子

亚临床甲状腺功能减退（subclinical hypothyroidism，SCH），临床简称亚甲减，是指由于甲状腺激素合成或释放障碍而导致甲状腺素分泌轻度减少，其实验室检查表现为血清促甲状腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）水平轻度升高，而血清游离甲状腺素（free thyroxine，fT4）和三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）水平正常［1］。研究［2-3］表明，亚甲减可导致学习记忆能力下降。孕期甲状腺功能低下可导致新生大鼠海马脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）表达下降［4］，而且TSH的中枢作用与BDNF的表达相关［5］。白藜芦醇（resveratrol，RES），化学名称为3，4′，5-三羟基-二苯乙烯，是一类主要存在于葡萄和虎杖等植物中的多酚类化合物，具有广泛的抗炎及神经保护作用［6-8］。该研究采用单侧甲状腺电凝毁损的方法建立亚甲减大鼠模型，观察RES对亚甲减大鼠在Morris水迷宫和Y迷宫中的行为、血浆甲状腺激素水平及海马中BDNF表达的影响，以阐明RES对亚甲减大鼠学习记忆能力的影响并探讨其可能机制，为RES的进一步开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料RES（美国Sigma公司）；左旋甲状腺素（levothyroxine，LT4）（德国默克公司）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；TSH的ELISA试剂盒（武汉华美生物有限公司）；T3和fT4放免试剂盒（北京北方所）；BDNF及β-actin一抗（美国Delaware公司）。RF-1双极电凝器（上海市检测技术所上立检测仪器厂）；高速冷冻离心机（美国Beckman公司）。

1.2 SCH大鼠模型建立雄性SD大鼠，由安徽省实验动物中心提供，适应性饲养1周后进行实验。采用单侧甲状腺电凝毁损术建立亚甲减大鼠模型，即麻醉后充分暴露甲状腺，电凝毁损右侧及峡部的甲状腺组织。假手术组（8只）则暴露甲状腺而不进行电凝毁损。手术后休息2周后将造模成功的24只SCH大鼠随机分为模型组、RES（15 mg/kg）组及LT4（60μg/kg）组，每组8只。各组按上述剂量灌胃给药，每天1次，持续2周。假手术组和模型组灌胃给予等体积溶媒。

1.3 行为学检测行为学实验在本院行为学实验室独立进行，实验期间摄像机实时记录大鼠的行为学表现并采用Any-maze行为学分析软件分析。

1.3.1Morris水迷宫 采用本课题组的Morris水迷宫测试系统，迷宫直径为1.6 m、高度为50 cm。实验期间用食用色素将池水染成黑色并保持水深30 cm、水温22～23℃，迷宫外参照物保持不变。实验分定位航行和空间搜索两部分。定位航行期间大鼠连续接受为期4 d的训练，每天4次，每次入水前将小鼠置于水下平台（水下1.3 cm）适应30 s，记录大鼠60 s内分别从4个象限不同入水点入水找到平台的游泳距离，4次平均成绩作为当日最终成绩进入最后统计。第5天进行空间搜索实验，即撤除平台，从平台对侧象限入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录60 s内的游泳轨迹并进行分析。

1.3.2Y迷宫 Y迷宫包含3个完全相同的封闭臂，每个臂长48 cm，宽10 cm，高20 cm。实验分训练期和检测期两个阶段。训练期将其中一个臂封闭起来作为新异臂，另两个臂一个固定为起始臂，一个为熟悉臂。将大鼠放入起始臂，使其在起始臂和熟悉臂探索10 min。24 h后进行检测，此时开放新异臂，允许大鼠在三臂内自由探索5 min，记录并分析大鼠在新异臂的移动距离、停留时间，根据公式计算新异臂优先指数。新异臂优先指数=新异臂移动距离/总移动距离。

1.4 大鼠血浆T3、fT4和TSH浓度检测行为学实验结束24 h后，10%水合氯醛麻醉后腹主动脉采血，ELISA方法检测血浆TSH浓度，放射免疫分析法检测血浆T3和fT4浓度。

1.5 Real-timePCR方法检测大鼠海马BDNF mRNA的表达每组随机选取5只大鼠，冰上分离双侧海马，液氮处理后-80℃保存。TRIzol裂解液裂解左侧海马，手动匀浆器匀浆。按TRIzol三步法提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书和引物反应条件进行逆转录和目的基因扩增，β-actin为内标。β-actin的引物序列为F：5′-TTGCTGACAGGATGCAGAA-3′和R：5′-ACCAATCCACACAGAGTACTT-3′；BDNF的引物序列为F：5′-GCGGCAGATAAAAAGACTGC-3′和R：5′-GTAGTTCGGCATTGCGAGTT-3′。反应体系为10μl，其中SYBR GreenMix（2х）5μl，cDNA 0.5μl，引物各0.3 μl，用无酶水补足。反应体系为10μl，其中SYBR Green Mix（2х）5μl，cDNA 0.5μl，引物各0.3μl，用无酶水补足。反应条件为：95℃，10min；95℃，15 s；60℃，30 s；72℃，30 s；45个循环。

1.6 Westernblot检测大鼠海马BDNF的表达RIPA裂解液裂解右侧海马，匀浆后进行蛋白定量。取匀浆后等量组织加入蛋白变性剂，在沸水中煮沸10min进行蛋白变性。变性后取50μg蛋白用15% SDS-PAGE凝胶电泳分离、转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h后，孵育相应一抗（BDNF及β-actin浓度均为1/1 000）并4℃过夜、洗脱后加二抗37℃孵育2 h，洗脱后ECL显色、曝光并进行定量分析。

1.7 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行分析，数据以-x±s表示。体重及Morris水迷宫中大鼠寻找平台游泳距离的比较采用重复测量的单因素方差分析，血浆甲状腺激素水平及大鼠其他行为学表现的组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD方法，相关性分析采用Pearson检验。

2 结果

2.1 RES对SCH大鼠体重及血浆甲状腺激素浓度的影响重复测量的单因素方差分析结果表明，分组（F=2.81，P=0.05）及时间因素（F=162.38，P＜0.01）均对SCH大鼠的体重有影响，且存在交互效应（F=5.28，P＜0.01）。见图1。

SCH大鼠血浆T3及fT4浓度与假手术组比较无显著性差异，但血浆TSH浓度显著上升（P＜0.01），符合人类SCH的诊断标准。与SCH组比较，LT4治疗可降低血浆TSH浓度（P＜0.01），但同时引起血浆fT4浓度显著上升（P＜0.01）。而RES（15 mg/kg）灌胃给药仅降低血浆TSH浓度（P＜0.05），对血浆T3及fT4浓度无明显影响。见表1。

2.2 RES对SCH大鼠学习记忆行为的影响

2.2.1RES对SCH大鼠在Morris水迷宫中行为的影响 各组大鼠在Morris水迷宫定位航行实验中找到水下平台的游泳距离见图2A。重复测量的单因素方差分析结果表明，分组（F=13.93，P＜0.01）及时间因素（F=31.40，P＜0.01）均对SCH大鼠找到水下平台的游泳距离有影响，两者之间无交互效应（F=1.349，P=0.90）。

空间搜索实验结果表明，各组大鼠在1 min自由游泳时间内的游泳总距离和游泳速度无显著性差异。与假手术组比较，SCH大鼠在平台所在的目标象限的游泳距离显著减少（P＜0.01），LT4和RES（15 mg/kg）灌胃给药则可改善这一现象（P＜0.01）。见图2B、C。

2.2.2RES对SCH大鼠在Y水迷宫中行为的影响

与假手术组比较，SCH大鼠在新异臂中的活动距离、停留时间和新异臂有限指数均显著降低（P＜0.01），LT4和RES（15 mg/kg）灌胃给药可增加SCH大鼠在新异臂中的活动距离、停留时间和新异臂优先指数（P＜0.01）。见图3。

2.3 RES对SCH大鼠海马BDNFmRNA表达的影响SCH大鼠海马BDNF的蛋白表达显著低于假手术组（P＜0.01），LT4和RES（15 mg/kg）灌胃给药可增加BDNF在大鼠海马的mRNA表达（P＜0.01）。见图4。Pearson相关性分析结果表明，BDNF在海马的mRNA表达与血浆TSH浓度呈负相关性（r=-0.637，P=0.002）。

2.4 RES对SCH大鼠海马BDNF蛋白表达的影响与假手术组比较，SCH大鼠海马BDNF的蛋白表达显著降低（P＜0.01），LT4和RES（15 mg/kg）灌胃给药可增加BDNF在大鼠海马的表达（P＜0.01）。见图5。Pearson相关性分析结果表明，BDNF在海马的蛋白表达与血浆TSH浓度呈负相关性（r=-0.717，P＜0.001）。

3 讨论

甲状腺激素替代疗法是目前临床治疗亚甲减的主要措施之一。然而，由于亚甲减患者外周血中甲状腺激素水平正常，亚甲减患者使用LT4的剂量难以确定。而且临床使用中可出现治疗过度引起的甲状腺功能亢进或亚临床甲状腺功能亢进等不良反应［9］。因而，寻找治疗亚甲减的新型药物是神经内分泌领域长期关注的研究内容之一。

本研究采用单侧甲状腺电凝手术建立了大鼠亚甲减模型并观察了RES对亚甲减大鼠甲状腺激素水平及学习记忆能力的影响。结果表明，亚甲减大鼠血浆TSH浓度显著上升而T3和fT4浓度无明显改变，LT4（60μg/kg）和RES（15 mg/kg）灌胃给药均可降低SCH大鼠升高的TSH浓度。RES调控亚甲减大鼠血浆甲状腺激素水平的能力可能与其和LT4相似的化学结构［10］、共同的作用位点［11］有关。值得一提的是，LT4治疗后亚甲减大鼠血浆TSH水平下降，但同时存在血浆fT4浓度的过度上升，这与亚甲减的临床甲状腺替代疗法中可导致14%～21%治疗过度的报道［9］相一致。而RES治疗则只改变血浆TSH水平，对fT4血浆浓度则无显著影响，引起甲亢、亚甲亢等治疗过度的不良反应有所降低。

行为学实验显示，亚甲减大鼠在Morris水迷宫的定位航行实验中找到水下平台所需的游泳距离延长，空间搜索实验中在目标象限的游泳距离和停留时间减少；在Y迷宫中的新异臂移动距离、停留时间均减少，新异臂优先指数下降，提示亚甲减大鼠存在学习记忆能力的下降。与临床研究［5］的结果相一致，阳性药物LT4治疗后可提高亚甲减大鼠在行为学实验中的表现。和LT4作用相仿，本研究结果提示RES也可改善亚甲减大鼠在Morris水迷宫和Y迷宫中的行为学表现。

海马部位BDNF的表达与学习记忆能力密切相关［12-13］，并受到甲状腺激素水平的影响［4-5］。本研究结果表明，亚甲减大鼠海马BDNF的mRNA及蛋白表达水平均显著下降，海马BDNF的表达与血浆TSH浓度呈负相关，证实了BDNF在亚甲减大鼠学习记忆能力损伤中的作用。LT4和RES治疗后则可显著上调海马BDNF的表达，提示RES的神经保护作用机制除了已经报道的抗氧化［8］及抗异常蛋白聚集作用［6-7］，还与调节海马BDNF的表达有关。

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Resveratrol im proves the im paired learning and memory in subclinical hypothyroidism rats and the possiblemechanism

Qin Gan，Xu Yayun，Cheng Jiangqun，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol（RES）on the learning andmemory of subclinical hypothyroidism（SCH）rats and explore the possible mechanism.MethodsA SCH rat model was established through hemi-thyroid electric coagulation，and the SCH rats were divided randomly into 3 groups including SCH model group，RES（15 mg/kg）group and levothyroxine（LT4，60μg/kg）group.The rats in the sham group were only exposed thyroid without electric coagulation.2 weeks after operation，all the 32 rats received a daily intragastric administration of sterile saline solution，RESor LT4 with the corresponding dose.The learning and memory abilities of the ratswere tested using Morriswatermaze（MWM）and Y maze.The plasma concentrations of thyrotropic-stimulating hormone（TSH），free thyroxine（fT4），and thiiodothyronine（T3）were detected using ELISA and radioimmunoassaymethod，respectively.ThemRNA and protein expression of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）wasmeasured via real-time PCR and western blotmethod，respectively.ResultsThe SCH ratmodelwas successfully duplicated，as indicated by the elevated plasma thyrotropic-stimulating hormone（TSH）level with no changes of free thyroxine（fT4）and triiodothyronine（T3）concentration.Both RES（15 mg/kg）and LT4（60 μg/kg）could decrease the TSH concentration.Moreover，treatment with LT4 resulted in the increase of plasma fT4 level.In the MWM task and the Y maze task，the spatial learning and memory of the SCH ratswere impaired compared with the sham ones.However，these changeswere reversed by the treatment of RES（15mg/kg）or LT4（60μg/kg）.Furthermore，RES treatment up-regulated the mRNA and protein expression levels of BDNF in the hippocampus.ConclusionThese findings suggest an amelioration effect of RES on the impaired spatial learning and memory in SCH rats，themechanism of which might be involved with itsmodifying effect on the imbalance of the thyroid function and the hippocampal expression of BDNF.

resveratrol；subclinical hypothyroidism；Morriswatermaze；Y maze；brain-derived neurotrophic factor

R 964

A

1000-1492（2016）03-0378-05

时间：2016/1/28 14：23：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.030.html

2015-12-25接收

高等学校博士学科点专项科研基金（编号：20133420120005）；安徽省2014年高校优秀人才支持计划（编号：KJ2014RC004）；安徽医科大学中青年学术骨干资料基金（编号：0601020103）；安徽省大学生创新创业训练计划项目（编号：AH201410366125）

安徽医科大学药学院，合肥 230032

秦 干，男，本科生；

葛金芳，女，博士，副教授，硕士生导师，E-mail：gejinfang@ ahmu.edu.cn