朱洪超，马　娣，王　飞，张瑞雪，陆晓晔，朱长清

(1.上海交通大学医学院附属仁济医院 急诊科，上海, 200127;2.安徽中医药大学第一附属医院 外科ICU,

安徽 合肥, 230000;3.上海嘉定区中心医院 急诊科，上海, 201800)



免疫增强比浊法和免疫荧光法测定血浆和尿液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的比较及诊断脓毒症急性肾损伤的价值

朱洪超1，马娣2，王飞3，张瑞雪1，陆晓晔1，朱长清1

(1.上海交通大学医学院附属仁济医院 急诊科，上海, 200127;2.安徽中医药大学第一附属医院 外科ICU,

安徽 合肥, 230000;3.上海嘉定区中心医院 急诊科，上海, 201800)

摘要:目的比较免疫增强比浊法和免疫荧光法在测定患者血浆和尿液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的差异，评估血浆和尿液NGAL值对诊断脓毒症患者发生急性肾损伤(AKI)的价值。方法选择脓毒症患者35例，根据是否发生AKI分为脓毒症AKI组(n=12)和脓毒症非AKI组(n=23)。另选取同期健康体检人群8例作为对照组。留取入院24 h内的血浆和尿液标本。采用免疫增强比浊法和免疫荧光法分别测定血浆和尿液标本的NGAL值。绘制ROC曲线评估血浆NGAL值预测脓毒症AKI的诊断效率。结果采用免疫增强比浊法进行测定，脓毒症组血浆和尿NGAL值均显著高于对照组 (P<0.01)。脓毒症AKI组血浆NGAL显著高于脓毒症非AKI组(P<0.05)，但2组尿NGAL值差异无统计学意义(P>0.01)。采用免疫荧光法进行测定，脓毒症组血浆NGAL值显著高于对照组(P<0.01)，脓毒症AKI组血浆NGAL值显著高于脓毒症非AKI组(P<0.05)。ROC分析表明，免疫增强比浊法曲线下面积0.785(95%CI：0.642～0.928)，免疫荧光法曲线下面积为0.853(95%CI：0.729～0.977)，约登指数最大时的判断点分别为0.575和0.567。结论血浆NGAL值可判断脓毒症AKI的发生，免疫荧光法较免疫增强比浊法更为准确。

关键词:脓毒症; 急性肾损伤; 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白; 免疫增强比浊法; 免疫荧光法

脓毒症(sepsis)是指由确定或者可疑感染引起的全身性炎症反应综合征。急性肾损伤(AKI)是一种由不同病因所致、具有不同临床表现并以肾小球滤过率迅速下降为主要特点的临床综合征，临床上危重症患者发生急性肾损伤的情况很常见，而且死亡率较高，多中心大规模临床试验表明脓毒症并发急性肾损伤患者的病死率为 44%，而未合并 AKI 的脓毒症患者的病死率为 21%[1-2]。因此，早期预估脓毒症患者发生AKI在临床上显得很重要。

目前临床常用血肌酐(SCr)和尿量作为诊断 AKI 的指标存在一定缺陷，并不能敏感地指示出肾脏损伤的最初阶段。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是一个近几年发展起来的肾损伤标志物，共价结合于中性粒细胞明胶酶，可在肾小管上皮受到损伤时表达显著增加[3-4]。本研究探讨了两种测定方法对于测定血浆和尿液NGAL值的差异及评估血浆和尿液NGAL对于诊断脓毒症患者发生急性肾损伤(AKI)的效力，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

收集入住上海交通大学附属仁济医院急诊科并已确诊为脓毒症的患者35例，其中男13例，女22例；住院期间12例发生AKI，设为脓毒症AKI组；其余23例设为脓毒症非AKI组。此外，另有8例同期健康体检的成人设为对照组。所有患者诊断均符合《国际严重脓毒症和脓毒症休克治疗指南(2012年修订版)》[5]，脓毒症AKI 诊断符合急性肾损伤的诊断和分级标准(RIFLE标准)。排除标准: ① 妊娠或哺乳期妇女; ② 年龄<18岁; ③ 慢性肾功能不全; ④ 免疫功能抑制及长期服用激素者。3组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表1。本研究获得患者及家属知情同意，通过了上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会批准。

表1　3组临床资料比较

*注：血浆肌酐值为病人入院前后24 h内最高值

1.2方法

收集受试者入院24 h内的血液标本3 mL和尿液标本10 mL，离心后放于-80 ℃冰箱冻存。所用试剂及耗材为：中性粒细胞明胶酶相关脂质转运蛋白测定试剂盒和NORMAN系列比浊分析仪(购自中国南京诺尔曼生物科技有限公司)、中性粒细胞明胶酶相关脂质转运蛋白检测试剂盒和TriageMeterPro荧光免疫分析仪(购自美国博适公司)。应用免疫增强比浊法测定血浆和尿液NGAL值，对同样的血浆样本，用免疫荧光法测定血浆NGAL值。对脓毒症AKI组，脓毒症非AKI组，对照组进行NGAL值组间比较，绘制ROC曲线。

免疫增强比浊法具体步骤如下：室温下解冻样本并充分混匀，加样本12 μL于样品反应杯中，然后加入240 μL试剂R1，等反应杯中散射光强度稳定后，加入60 μL试剂R2，在1～2 min内，测定散射光的变化率。免疫荧光法具体步骤如下：室温下解冻样本并充分混匀，在测试板上标记样本编号并录入配套仪器中，将样本加入测试板孔中，在20～30 min内测定免疫荧光值。

1.3统计学处理

2结果

2.1免疫增强比浊法测定各组间血浆和尿液NGAL浓度比较

免疫增强比浊法测定血浆和尿液NGAL，显示脓毒症组血浆和尿NGAL值均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。而且脓毒症AKI组血浆NGAL高于脓毒症非AKI组，差异有统计学意义(P<0.05)，但2组间尿NGAL值差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　各组免疫增强比浊法测定的血浆和尿液NGAL浓度比较

与对照组比较, **P<0.01; 与脓毒症非AKI组比较, #P<0.05。

2.2免疫荧光法测定各组血浆NGAL浓度比较

免疫荧光法测定血浆NGAL, 脓毒症组血浆NGAL值高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，脓毒症AKI组血浆NGAL值高于脓毒症非AKI组，差异有统计学意义(P<0.05), 见表3。

表3　各组免疫荧光法测定的血浆NGAL浓度比较

注：与对照组比较, **P<0.01;

与脓毒症非AKI组比较, #P<0.05。

2.3两种方法测定的血浆NGAL值预判AKI绘制ROC曲线

免疫增强比浊法预测AKI的曲线下面积是0.785，95%CI: 0.642～0.928,P<0.01。约登指数为0.575时，最佳截断值是237.50，相应敏感度是0.833，特异度是0.742。免疫荧光法预测曲线下面积是0.853，95%CI: 0.729～0.977,P<0.01。约登指数是0.567时，最佳截断值是215.50, 相应敏感度是0.667, 特异度是0.900(见图1、2)。

图1 免疫增强比浊法ROC曲线

图2 免疫荧光法ROC曲线

3讨论

近年来, AKI在急诊危重症患者中的发生率和死亡率逐渐升高，脓毒症更是AKI发病的重要原因之一，严重影响了危重患者的生存，相应的医疗费用也逐渐增高[6-7]。因而深入分析AKI的流行病学特征，了解其相关特异性生物标志物，对于AKI的早期预防、诊断和挽救肾功能具有重要意义。目前在临床上诊断AKI的主要指标有尿量、肌酐、尿素氮等。AKI的诊断标准主要靠血清肌酐(SCr)和尿量的变化，但是事实上, SCr并不是一个敏感的检测指标，当SCr明显升高的时候，肾小球功能已经受到了严重影响，尿量更容易被患者容量状态和药物等因素干扰[8-9]。NGAL是脂质运载蛋白家族成员，分子量为25 KD，共价键结合于中性粒细胞明胶酶，在人类许多组织中如肾脏、肺中呈低表达，在上皮细胞受到刺激后表达显著增高。在缺血性、脓毒症AKI以及肾移植术后均能在血液和尿液中检测到NGAL大量增加[10]。 近年来对于NGAL的研究[11-12]主要集中于其与急性肾损害之间的相关性。损伤的肾小管上皮表达NGAL，诱导肾小管间质中浸润的中性粒细胞发生凋亡，从而保护肾组织免于炎症损害。研究[13-14]发现在心脏术后及放射性暴露等引起的急性肾损害者，其血浆及尿液中的NGAL可以作为AKI早期的一个标记。对于危重患者，脓毒症及多发伤所致急性肾损害患者血浆中NGAL均明显升高且与预后密切相关[15]。本研究也支持关于NGAL对急性肾损伤有早期指示作用的观点。所有脓毒症患者比健康对照组的血浆和尿液NGAL都高，脓毒症伴有AKI比不伴有AKI的血浆和尿液NGAL显著增高。

NGAL的检测方法一开始是蛋白印记法，2005年丹麦的BioPorto公司首先推出酶联免疫吸附测定商品试剂盒，可用于血和尿的NGAL检测。该法采用双抗体夹心法，敏感度高、线性范围宽、特异性好及重复性高，但一般比较耗时，难以自动化进行，而且对标本保存条件要求高，容易受到细菌干扰，因而NGAL的检测标准化会是将来研究的一个重点方向。本研究对比了免疫增强比浊法和免疫荧光法。结论显示免疫荧光法(AUC=0.853)比免疫比浊法(AUC=0.785)ROC曲线下面积大，免疫增强比浊法灵敏度较高而免疫荧光法特异度较高，整体上比较，免疫荧光法更好。

本研究的不足在于样本例数仍然偏少，没有进行连续动态的NGAL检测，免疫增强比浊法和免疫荧光法在临床应用的比较结果，有待于大规模多中心的前瞻性临床研究来进一步验证。有相关研究提示尿液NGAL似乎比血浆NGAL更准确，但是在本次研究中，没有发现这样的结论，这方面有待进一步进行临床研究评估。

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Comparison between immune enhancement turbidimetry and immumofluorescence methodin detections of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in plasma and urine and their values in diagnosis of sepsis-induced acute kidney injury

ZHU Hongchao1, MA Di2, WANG Fei3, ZHANG Ruixue1,

LU Xiaoye1, ZHU Changqing1

(1.EmergencyDepartment,RenjiHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 200127; 2.ICU,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei,Anhui, 230000; 3.EmergencyDepartment,TheCentralHospitalofJiadingDistrictinShanghai,Shanghai, 201800)

ABSTRACT:ObjectiveTo compare the effect of immune enhancement turbidimetry and immumofluorescence method in detections of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in plasma and urine and evaluate the value of NGAL in diagnosis of sepsis-induced acute kidney injury (AKI). MethodsAccording to the presence of AKI, 35 patients with sepsis were selected and divided into sepsis AKI group (n=12) and sepsis non-AKI group (n=23). Eight healthy people in the same period were selected as control group. The plasma and urine samples were collected. Immune enhancement turbidimetry and immumofluorescence method were used to detect the value of NGAL in plasma and urine. ROC curves were drawn for evaluating the value of NGAL in plasma in predicting the diagnostic efficiency of AKI. ResultsFor the immune enhancement turbidimetry, the values of NGAL in plasma and urine in sepsis group were significantly higher than those in the control group (P<0.01). The value of NGAL in plasma in sepsis AKI group was significantly higher than that in the sepsis non-AKI group, but there was no significant difference in value of NGAL in urine between two groups (P>0.05). For the immumofluorescence method, the value of NGAL in plasma in sepsis group were significantly higher than that in the control group (P<0.01), and the value of NGAL in plasma in the sepsis AKI group was significantly higher than that in the sepsis non-AKI group (P<0.01). ROC curves showed that the area under the curve for immune enhancement turbidimetry was 0.785 (95%CI: 0.642～0.928), and the area under the curve for immumofluorescence method was 0.853 (95%CI: 0.729～0.977). The critical values of Youden index at maximum were 0.575 and 0.567. ConclusionThe value of NGAL in plasma can judge the occurrence of sepsis-induced AKI. Immumofluorescence method is more accurate than immune enhancement turbidimetry.

KEYWORDS:sepsis; acute kidney injury; neutrophil gelatinase-associated lipocalin; immune enhancement turbidimetry; immumofluorescence method

通信作者:朱长清, E-mail: zhucq1965@126.com

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11523221)

收稿日期:2015-10-23

中图分类号:R 692

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)03-032-04

DOI:10.7619/jcmp.201603010