贾　佳，高　磊，王先恒，胡乔乔，马佳慧，徐昆仑，赵长阔

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸及其盐的合成和抗肝癌活性

贾佳，高磊，王先恒，胡乔乔，马佳慧，徐昆仑，赵长阔

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 为降低斑蝥素毒副作用并改善其水溶性，设计合成新型斑蝥素的衍生物及其盐。方法 以呋喃为原料，与顺丁烯二酸酐在有机溶剂中反应得到5-烯去甲斑蝥素，此产物在有机溶剂中经LiAlH4还原反应得到5-烯去甲斑蝥素二醇，后者与溴乙酸乙酯反应得到5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸乙酯，该酯在碱性条件下水解生成相应的去甲斑蝥素氧代单乙酸及其盐。用磺酰罗丹明(sulforhodamine B，SRB)染色法对最终产物进行抗肝癌活性测试。结果 新型斑蝥素的衍生物——5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸及其盐抗肝癌活性测试的结果表明，5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸及其盐的浓度5 μg/mL对人肝癌细胞Hep G2具有一定抑制效果，抑制率分别为50%和65%。结论 本研究方法制得的5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸及其盐具有一定的抗肝癌效果。

[关键词]斑蝥素；5-烯去甲斑蝥素；合成；抗肝癌活性

斑蝥素(cantharidin，C10H12O4)是从昆虫斑蝥体内提取的抗癌物质，对肝癌、卵巢癌、食道癌等有良好疗效，与其他常用抗肿瘤药物相比，有许多优点，如斑蝥素和它的类似物不抑制人体的免疫功能，并可提升人体白细胞数量等[1]。斑蝥素是通过改变肿瘤细胞蛋白质活性，抗肿瘤侵袭转移，引起细胞周期阻滞，抑制肿瘤生长，从而使其死亡[1-2]。其抗肿瘤机制为通过减少癌细胞对氨基酸的摄取，抑制蛋白质的合成，刺激淋巴细胞、巨噬细胞、多形核细胞产生白细胞介素，从而提高机体免疫力，同时杀伤肿瘤细胞而达到治疗目的。但斑蝥素对泌尿系统和肠胃系统有较大毒副作用，斑蝥素既是抗肿瘤的活性成分，同时也是毒性的主要成分。对其进行恰当的结构修饰，会在保留其抗肿瘤活性的基础上，大大降低对机体的毒副作用[1-3]。

近年来，对斑蝥素进行结构修饰后用于治疗癌症的衍生物被陆续报道，并开始运用于临床治疗。如去甲斑蝥素，比斑蝥素少了2个甲基，其毒性明显降低，而治疗作用却优于斑蝥素[4]。另外还有斑蝥素钠、去甲斑蝥素钠、甲基斑蝥胺等[4-6]，这些经结构改造的药物虽然各有优点，但却有其共同的缺陷，主要表现在水溶性较差，生物利用度不高。目前用于临床治疗的斑蝥素药物(如斑蝥素钠、去甲斑蝥素钠等)中，均以开环方式存在，从化学结构上看，开环化合物的溶解度较大，其体内生物利用度也高。因此对斑蝥素的结构进行修饰，寻找高效低毒的斑蝥素抗肿瘤药物，具有重要的工业应用价值和广泛的市场前景。本研究拟设计合成一种新型水溶性去甲斑蝥素衍生物，期望在其结构中引入水溶性基团，增加其生物利用度，达到增加治疗效果的目的。

1试剂与仪器

1.1试剂顺丁烯二酸酐、呋喃、LiAlH4、NaH(分析纯，国药集团)；石油醚、溴代乙酸乙酯、乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(分析纯，成都科龙化工)；NaOH(分析纯，上海化学试剂厂)。

1.2仪器81-2型暗箱三用紫外分析仪(上海司乐仪器有限公司)；Varian 400MHz核磁共振波谱仪(安捷伦科技有限公司)。

2方法与结果

2.15-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸及其盐的合成5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸及其盐的合成路线(见图1)。

图1　5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸钠盐合成

2.1.1中间体A(5-烯去甲斑蝥素)的制备[7-8]

先将顺丁烯二酸酐用研钵研细，再称取12.02 g研细的顺丁烯二酸酐并置于三口瓶中，逐渐加入90 mL乙醚至研细的顺丁烯二酸酐完全溶解，再于13 min内缓慢滴加13 mL 呋喃。滴毕，控制温度38 ℃下反应1 h,有白色沉淀生成，继续反应24 h后，抽滤，得白色固体17.46 g，收率为85.75%。熔点：122~123 ℃，Rf(保留因子)：0.52 (展开剂为：石油醚∶乙酸乙酯=3∶1)；1HNMR(400 MHz, CDCl3) δ: 3.18 (s, 2H), 5.47 (s, 2H), 6.58 (s, 2H)(见图2)。

2.1.2中间体B(5-烯去甲斑蝥素二醇)的制备[9-10]

称取已生成的中间体A 2.0 g于烧瓶中并加入25 mL除去水的THF(四氢呋喃)，冰浴搅拌至溶液澄清。分4批缓慢加入LiAlH4(689 mg)，反应24 h。加乙酸乙酯、水淬灭反应，反应稳定后抽滤，用乙酸乙酯、水反复滤洗3次，合并滤液并旋干，得5-烯去甲斑蝥素二醇(中间体B)的粗品2.05 g，收率>100%。Rf：0.21 (展开剂为乙酸乙酯)；1HNMR(400 MHz, CDCl3) δ: 6.39 (s, 2H), 4.68 (s, 2H), 3.76~3.83 (m, 4H), 1.95 (t, 2H)(见图3)。

2.1.3中间体C(5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸乙酯)的制备取1.3 g上述中间体B粗品于烧瓶中并加25 mL除去水的THF，冰浴搅拌，再加入NaH (60%, 513 mg)和溴乙酸乙酯(1.4 mL)，反应24 h，抽滤，旋干，得粗品1.7 g。利用柱色谱层析原理将粗品通过硅胶柱进行分离，得到中间体C 0.45 g，收率为45%。Rf：0.67 (展开剂为石油醚：乙酸乙酯= 5:1)；1HNMR(400 MHz, CDCl3) δ: 6.37~6.42 (m, 2H), 4.76~4.77 (t, 2H),4.21 (m, 2H), 4.09 (m, 2H), 3.78 (m, 2H), 3.63~3.65 (m, 2H), 1.93~2.08 (m, 2H), 1.27~1.31 (t,3H)(见图4)。

2.1.4化合物D(5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸)的制备取中间体C 0.45 g于烧瓶中，加入9 mL水，搅拌，再加入NaOH 148 mg，反应24 h 。加10% HCl调 pH 4~5，旋干。通过硅胶柱分离得化合物D 0.31 g，收率为78%。Rf：0.25(乙酸乙酯∶乙醇=5∶1)；1HNMR(400MHz, D2O) δ: 6.35 (s, 2H), 4.68~4.76 (d, 2H), 3.56~4.05 (m, 6H), 1.88~2.01 (m, 2H)(见图5)。

2.1.5化合物E(5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸钠盐)的制备取化合物D 0.50 g溶于5 mL甲醇和1 mL水中，加入NaOH 160 mg，溶剂旋干，通过硅胶柱分离可得化合物D的钠盐，即化合物E 0.52 g，收率为95%。1HNMR(400 MHz, D2O) δ: 6.30 (s, 2H), 4.75~4.79 (d, 2H), 3.32~3.81 (m, 6H), 1.77~1.90 (m, 2H);13CNMR(100 MHz, D2O) δ: 177.70, 135.23, 80.75, 80.51, 70.08, 69.68, 60.59, 41.17, 38.83(见图6、7)。

2.2抗肝癌活性测试

2.2.1抗肝癌活性测试方法磺酰罗丹明(sulforhodamine B, SRB)染色法：接种细胞时，每种细胞平行接种2块96孔板，一块为对照板，另一块为实验板。CO2培养箱中培养20 h后，将对照板取出，用50%三氯乙酸(TCA)固定，待测。实验板中加入待测化合物(终浓度分别为5、2.5、1.25、0.625、0.313 μg/mL)，并设阳性对照组、实验组和溶剂对照组。每组设5个复孔，继续培养48 h后取出培养板，以预冷50% TCA固定(终浓度为10%)，4 ℃冰箱放置1 h后，以去离子水冲洗，自然晾干，用100 μL 0.4%的SRB染色，10 min后用0.1%乙酸冲洗、晾干，最后用200 μL 10 mmol/L的缓冲Tris碱液(pH 10.5)溶解，在酶标仪上选择530 nm处测吸光度值(OD值)，按照下列公式计算生长抑制率(inhibition ratio，IR)。

肿瘤细胞生长抑制率=

2.2.2抗肝癌活性测试结果以斑蟊素为阳性对照，5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸(D)及其钠盐(E)对人肝癌细胞Hep G2的抑制活性为，当浓度c=5 μg/mL时, 化合物D和E对人肝癌细胞Hep G2的抑制率分别为50%和65%(见表1)。

表1各化合物对人肝癌细胞Hep G2的抑制率(%)

指标 化合物斑蟊素5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸(D)5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸钠盐(E)抑制率855065

3讨论

本文通过药物设计并合成得到了一类新型水溶性去甲斑蝥素衍生物D及其钠盐E。合成共分4步反应，每步反应均采用全合成的方法，制备简单，可操作性强，使用的原料价格便宜。单步收率分别为：85.75%、100%、45%和78%，综合收率在30%以上。通过核磁共振氢谱、碳谱对其结构进行了表征，结果与预期结构相吻合。证实了目标化合物的成功制备。

结果发现，由于其结构中引入水溶性基团(-COOH)，因此增加了其在水中的溶解性。同时对反应产物D及其盐E进行了抗肝癌活性测试，当浓度c=5 μg/mL时, 化合物D和E对人肝癌细胞Hep G2的抑制率分别为50%和65%，说明所设计的5-烯去甲斑蝥素氧代单乙酸及其钠盐对人肝癌细胞Hep G2具有一定的抑制效果。然而其抑制作用比斑蝥素弱，提示斑蝥素结构中的羰基或为必须的药效基团，这为以后的结构修饰指明了方向。

[参考文献]

[1] 娄田田，杜鹃，陈祥盛，等. 斑蝥素及其衍生物抗肿瘤机制的研究进展[J]. 亚太传统医药, 2012, 8(10): 205-207.

[2] 安中原，王正，赵越. 斑蝥素及其衍生物的抗肿瘤进展[J]. 亚太传统医药, 2009, 5(1):128-130.

[3] 杨石康,蔡兴华,林心舜. 斑蝥素瘤体注射治疗原发性肝癌的疗效观察[J].福建中医药, 1994, 25(4): 8.

[4] 董环文，刘超美，李科. 新型去甲斑蝥素衍生物的设计合成及体外抗肿瘤活性[J]. 第二军医大学药学学报, 2008, 29(12): 1470-1474.

[5] 邓丽萍. 1.3-偶极环加成: 去甲斑蝥素衍生物的合成和构效关系[D]. 杭州: 浙江大学, 2007.

[6] 董环文，刘超美，李科，等. 新型去甲斑蝥素衍生物的设计合成及体外抗肿瘤活性[J]. 第二军医大学学报, 2008, 29(12): 1470-1474.

[7] 张沛，赵长阔，张志军, 等. 5,6-二氢去甲斑蝥素氧代单乙酸钠的合成方法和抗肝癌活性[P]. 中国发明专利: CN201510476728.6 (2015).

[8] Deng L, Chen Y G, Tian S K. Catalytic asymmetric desymmetrization of prochiral and meso compounds[P]. United States Patent: 7053236 (2004).

[9] Scott B, Wolfgang D, Paul R H, et al. Copper-catalysed meso-bislactone ring opening using Grignard and mixed triorganozinc reagents[J]. Tetrahedron Letters, 2006, 47(40): 7205-7208.

[10]Vo-Quang Y, Carniato D, Vo-Quang L, et al. A convenient one-pot synthesis of polyenic enol ethers[J]. J Chem Soc Chem Commun, 1983, 24(24): 1505-1506.

[收稿2015-12-01;修回2016-01-09]

(编辑：王静)

The synthesis and anti-hepatoma activity of 5-en-norcantharidin oxo-mono-acetic acid and its salt

JiaJia,GaoLei，WangXianheng,HuQiaoqiao，MaJiahui，XuKunlun，ZhaoChangkuo

(Department of Pharmacy，Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective A new type of norcantharidin derivatives and its salt were designed and synthesized to reduce the toxicity and improve the water solubility of the cantharidin. Methods Furan reacted with maleic anhydride to generate 5-en-norcantharidin in organic solvent In. the following, 5-en-norcantharidin was reduced by lithium aluminium hydride (LiAlH4) to afford 5-en-norcantharidin glycol; Then, using tetrahydrofuran as the solvent, 5-en-norcantharidin glycol was reacted with ethyl bromoacetate in the catalysis of sodium hydride to produce 5-en-norcantharidin oxo-mono-acetate. Finally the oxo-mono-acetate was hydrolyzed in alkaline condition, to generate the target compound oxo-mono-acetic acid and its salt. Anti hepatoma activity was tested by sulforhodamine B staining method. Results The result of anti-hepatoma activity showed that the 5-en-norcantharidin oxo-mono-acetic acid and its salt had shown 50% and 65% inhibition on hepatoma HepG2 cells respectively when its concentration of 5 μg/ml. Conclusion The 5-en-norcantharidin oxo-mono-acetic acid and its salt showed a moderate inhibition on Hep G2 cells, which can be used as a kind of high efficiency and low toxicity of cantharidin antitumor drug candidate.

[Key words]Cantharidin；5-en-norcantharidin；synthesis；anti-hepatoma activity

[中图法分类号]R914

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)01-0026-04

[通信作者]赵长阔，男，博士，副教授，研究方向：新药研发及化学仿制药工艺研发，E-mail:zck7103@hotmail.com。

[基金项目]贵州省科技厅联合基金资助项目(NO：黔科合LH字[2014]7545)。