谢同林, 王　方, 谢成明, 余　舰

(1.遵义医学院附属医院 司法鉴定中心，贵州 遵义　563099;2.金沙县公安局，贵州 金沙　551800)



基础医学研究

MMP-9、TIMP-1在羊水栓塞大鼠模型的表达及意义

谢同林1, 王方2, 谢成明1, 余舰1

(1.遵义医学院附属医院 司法鉴定中心，贵州 遵义563099;2.金沙县公安局，贵州 金沙551800)

[摘要]目的 通过检测孕鼠羊水栓塞(AFE)后血清及肺组织基质金属蛋白酶9(MMP-9)及基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)的含量水平变化，探讨其与AFE的关系。方法 30只健康SD孕晚期大鼠根据注入液体性质不同随机分为NS组、AF组及MAF组(n=10)，建立AFE动物模型，HE染色观察肺组织病理变化，IHC检测肺组织MMP-9、TIMP-1的表达水平，ELISA测定实验前后血清MMP-9、TIMP-1水平变化。结果 HE染色见AF及MAF组肺组织内充血、水肿，大量炎性细胞浸润，部分血管可见角化丝状物质。IHC显示AF组及MAF组MMP-9较NS组的表达明显上调(P<0.05)，AF组及MAF组较NS组的TIMP-1表达明显下调(P<0.05)，ELISA法显示实验后MMP-9浓度增加、TIMP-1的浓度降低；MMP-9/TIMP-1比例失衡，以MAF组最明显，症状出现最早，最严重。结论 MMP-9表达上调、TIMP-1下调及MMP-9/TIMP-1比例失衡可能参与了羊水栓塞肺部病变的发生发展，可能是羊水栓塞肺损伤的发病机制之一。

[关键词]羊水栓塞；基质金属蛋白酶9；基质金属蛋白酶抑制剂1；炎症反应；肺损伤

羊水栓塞(amniotic fluid embolism，AFE)是一种发病率低、死亡率高、不可预测的产科并发症，是导致产妇死亡的重要原因之一。近10年来，AFE发病机制的研究仍十分有限，从“机械栓塞学说”转向“妊娠过敏反应学说”及“炎症瀑布学说”[1-2]，但仍然是个谜。国内外有报道[3-4]机体发生羊水栓塞后体内炎症因子明显增加；Clark[5]最近报道AFE发病机制更倾向于全身炎症反应综合症所致的感染性休克。本研究通过建立大鼠羊水栓塞模型探讨炎症调节因子基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)和基质金属蛋白酶组织抑制剂1(Tissue inhibitor of matrixmetalloproteinases -1 TIMP-1)在AFE的表达及意义。

1材料与方法

1.1实验动物和模型制备30只健康SD孕晚期大鼠，体重(300±50) g(第三军医大实验动物部提供)根据从腹主静脉注入液体性质不同随机分为生理盐水组(NS组，n=10)、羊水原液组(AF组，n=10)、羊水胎粪液组(MAF组，n=10)，建立大鼠羊水栓塞模型[6]。

1.2标本采集术前麻醉生效后眼眶取血2 mL，剖宫产1 h后腹主动脉取血2 mL，标本离心(2 000 r/min，10 min)、分离，-80 ℃保存待检；术中取下子宫并破膜取羊水5 mL，部分用于配成羊水原液[6]，余同上；另用新生鼠取胎粪，配成羊水胎粪液，取每只大鼠右肺组织及相连的支气管用于石蜡包埋、切片，用于HE染色和免疫组化。

1.3主要试剂Rabbit Anti-MMP-9(北京博奥森生物有限公司)，Rabbit Anti TIMP-1(北京博奥森生物有限公司)，Polink-1二抗(中杉金桥公司)，MMP-9酶联免疫法试剂(北京诚林生物科技有限公司)，TIMP-1酶联免疫法试剂盒(北京诚林生物科技有限公司)。

1.4免疫组化法检测肺组织MMP-9、TIMP-1表达参照SP免疫组化法进行操作，加以改进，TIMP-1抗体和MMP-9抗体均1∶300稀释，肺泡壁细胞、炎性细胞、血管平滑肌细胞胞浆内呈棕黄色颗粒样改变为阳性。

1.5ELISA法检测血清MMP-9及TIMP-1水平参照试剂盒推荐采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)测定，实验操作严格按照试剂盒说明进行，根据标准品得出标准曲线，然后求出MMP-9、TIMP-1浓度值。

2结果

2.1模型组孕鼠的临床表现NS组从腹主静脉注入生理盐水后出现短暂性呼吸加快，后逐渐恢复，穿刺腹主动脉后止血时间为1 min。AF组先出现心率加快，然后变慢，且持续时间更长，并出现呼吸频率加快，止血时间为3~6 min，期间出现局部抽搐、小便失禁等症状；MAF组出现类似症状时间更早且更严重，并且有明显凝血功能障碍表现，穿刺后止血时间10~15 min。

A：生理盐水组(NS组)；B：羊水原液组(AF组)；C：羊水胎粪液组(MAF组)。箭头所指为小血管内角化物质。图1　大鼠肺组织HE染色(×200)

2.2HE染色结果NS组镜下未见明显异常，AF组、MAF组见肺泡间隔增宽，有不同程度充血、水肿，并伴有炎症细胞浸润，部分肺小血管内可见淡染的不定形物质和角化物质，其中MAF组更多(见图1)。2.3肺组织MMP-9、TIMP-1的免疫组化表达结果NS组肺泡壁细胞胞浆内、肺血管平滑肌、部分淋巴细胞和单核细胞中表达少量的MMP-9，颜色较浅(见图2A)；AF组可见MMP-9阳性表达(见图2B)，MAF组可见MMP-9强阳性表达(见图2C)；用IPPWIN32软件进行阳性率分析，与NS组相比其余组MMP-9表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)，AF组、MAF组间比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。NS组肺泡壁细胞胞浆内、肺血管平滑肌、部分淋巴细胞和单核细胞中大量TIMP-1表达，颜色较深(见图2D)；AF组、MAF组有一定TIMP-1阳性表达，颜色较浅，较NS组明显减少(见图2E、2F)。用IPPWIN32软件进行阳性率分析，与NS组相比其余组TIMP-1表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)，AF组、MAF组间比较差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

组别MMP-9TIMP-1NS组11.72±0.4524.11±0.56AF组22.12±0.6811.77±0.32MAF组28.63±0.805.82±0.35

MMP-9各组间比较P<0.05, TIMP-1各组间比较P<0.05。

A、B、C为MMP-9免疫组化结果，A为NS组，肺泡壁细胞胞浆表达较浅，为弱阳性，B为AF组，阳性，C为MAF组，强阳性；D、E、F为TIMP-1免疫组化结果，D为NS组，强阳性，E为AF组，阳性，F为MAF组，弱阳性。图2　大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1免疫组化结果(SP，×400)

2.4血清MMP-9、TIMP-1酶联免疫吸附实验检测结果各组MMP-9实验前比较均无统计学意义(P>0.05)；实验后各组间两两比较均有统计学意义(P<0.05)；AF组、MAF组实验前与实验后组内比较均有统计学意义(P<0.05)，以MAF组明显(见表2)。各组TIMP-1实验前比较均无统计学意义(P>0.05)；实验后各组间两两比较均有统计学意义(P<0.05)；AF组、MAF组实验前与实验后组内比较均有统计学意义(P<0.05)，以MAF组明显(见表2)。

表2ELISA法测定各组实验前、后血清MMP-9和TIMP-1的浓度(n=10)

组别MMP-9浓度(μg/L)实验前实验后TIMP-1浓度(pg/mL)实验前实验后NS组33.591±3.77635.818±4.3695735.603±278.6445734.821±340.871AF组31.716±0.43037.103±0.430●5507.364±447.4585099.182±421.464●MAF组32.691±1.56147.508±3.284●5779.209±347.2414501.907±340.366●

MMP-9、TIMP-1实验前各组间比较P>0.05；实验后各组间比较P<0.05；●组与实验前比较P<0.05。

3讨论

MMP-9是MMPs降解IV型胶原的最主要成员之一，其主要底物包括明胶，IV、V、VII型胶原，蛋白聚糖，纤维结合素，弹性蛋白。通常在中性条件下具有活性，有钙离子参与时活性最大，正常稳定细胞不产生MMP-9或产生极微量的MMP-9。肺组织MMP-9主要由中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等炎性细胞产生。TIMP-1是一类多肽，主要由巨噬细胞和结缔组织产生，能特异性与MMP-9催化活化中心的锌离子结合，而封闭其催化中心，从而使MMP-9失去降解细胞外基质的活性。研究发现[7]，正常情况下，构成肺泡壁的细胞外基质一直维持在合成与降解的动态平衡中，而MMP-9及TIMP-1的动态平衡，目前被认为是反映气道组织破坏与修复动态平衡的标志，MMP-9/TIMP-1比例失衡越明显，肺损伤也越严重，呼吸系统症状更明显、严重。MMP-9作为炎症因子的调节者[8]，可以将TNF-α、IL-6前体及IL-8裂解激活，而TNF-α、IL-6等多种细胞因子可上调MMP-9表达，使MMP-9表达增加，它们之间通过正反馈调节，使机体形成了“瀑布式炎症反应”，从而加剧了急性肺损伤的发生发展，导致机体出现严重的呼吸困难、低氧血症，最终出现呼吸骤停。研究还显示[8]：MMP-9/TIMP-1失衡，引起MMP-9含量和活性增加，在急性肺损伤、DIC、免疫炎症反应、神经损伤等多种疾病中发挥着重要作用。Vadillo-ortega等[9]发现产妇孕晚期羊水MMP-9的活性较孕早中期的高，以分娩时羊水MMP-9的活性最高；使用TIMP-1后羊水MMP-9的活性有所下降，以分娩时活性下降的最为突出。研究发现，羊水栓塞肺部病理变化主要是肺水肿、肺损伤[10]。肺组织的炎性反应是导致急性肺损伤的决定性因素， 如果免疫调控继续进展，机体可能出现SIRS，甚至出现多器官功能衰竭(MODS)。

本研究结果显示，HE染色可以见到血管内角化物质，认为建立AFE模型成功[6]。AF组、MAF组肺组织MMP-9表达明显增加，AF组、MAF组实验后血清MMP-9明显升高，均以MAF组明显，提示AFE后MMP-9表达上调。通过相关性分析初步发现，肺组织及血清的MMP-9水平与AFE发生的早和严重程度呈正相关，即AFE发生越早，越严重，肺组织及血清中MMP-9水平上调更明显。而TIMP-1表达水平刚好相反，AF组、MAF组肺组织TIMP-1表达明显减少，AF组、MAF组实验后血清MMP-9明显降低，均以MAF组明显，提示AFE后TIMP-1表达下调，通过相关性分析初步发现，肺组织及血清的TIMP-1水平与AFE发生的早和严重程度呈负相关；即AFE发生越早，越严重，肺组织及血清中TIMP-1水平下调更明显。研究还发现MAF组MMP-9/TIMP-1比例失衡最明显，呼吸系统症状出现最早且最严重，也表明在胎粪中可能存在某种成分容易使MMP-9水平上调或者TIMP-1水平下调，具体还需进一步研究。

综上所述，当AFE发生时，羊水及胎粪中的MMP-9或羊水某种成分直接刺激肺组织及血清中MMP-9水平上调及TIMP-1水平下调，并引起MMP-9/TIMP-1的动态失衡，可能参与了AFE的肺损伤发生发展；MMP-9及TIMP-1水平可反映AFE患者的严重程度，并且可作为早期诊断发现AFE的一个新指标。如何阻止MMP-9活性表达或增加TIMP-1的表达，降低AFE的发生率及减轻AFE发生的严重程度，可能将成为羊水栓塞诊疗的新途径。

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[收稿2015-11-27;修回2015-12-29]

(编辑：王静)

Expression and significance of MMP-9 and TIMP-1 in rat model of amniotic fluid embolism

XieTonglin1,WangFang2,XieChengming1,YuJian1

(1.Department of Forensic Judicial Identification Center, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Public Security Bureau of Jinsha, Jinsha Guizhou 551800, China)

[Abstract]Objective To investigate the expression level changes of MMP-9 and TIMP-1 in serum and lung tissue of amniotic fluid embolism(AFE)rats, and to explore the relations with AFE. Methods The pregnancy SD rats were randomly divided into control group (NS, n=10), amniotic fluid group (AF,n=10), the mixture of amniotic fluid meconium group (MAF,n=10), which to set up the AFE model. The lung tissues were collected for HE staining. The right lung expression of MMP-9 and TIMP-1 was detected by immunohistochemistry technique. The levels of MMP-9 and TIMP-1 were using the enzyme-linked immunosorbent assay of serum, amniotic fluid and amniotic fluid meconium. Results HE staining: AF group and MAF group had different degree of hypenemia, edema, accompanied with acute inflammatory cells, keratinized silk materials could be found in some lung vessels MMP-9 and TIMP-1 IHC examination: the expression in AF group and MAF group MMP-9 was increased (P<0.05).However, the expression in AF and MAF group TIMP-1 was depressed (P<0.05).The ratio of MMP-9/TIMP-1 was also increased in lung tissue of AFE rats. The changes became much more obvious in MAF group. Conclusion The changes of MMP-9, TIMP-1 and the ratio of MMP-9/TIMP-1 in lung tissue of AFE rats may be related to lung tissue pathological changes, which may be one of the mechanisms for AFE.

[Key words]amniotic fluid embolism; matrix metalloproteinase-9; tissue inhibitor of matrixmetalloproteinases-1; inflammatory reaction; lung injury

[中图法分类号]R714.46

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)01-0022-04

[通信作者]余舰，男，教授，硕士生导师，研究方向：法医病理学，E-mail:783065265@qq.com。

[基金项目]贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合J[2012]2358)。