张 爽，李异玲

中国医科大学附属第一医院消化内科，辽宁 沈阳 110001

专题·非酒精性脂肪性肝病

TM6SF2 rs58542926 E167K单核苷酸多态性与非酒精性脂肪性肝病易感性的关系

张 爽，李异玲

中国医科大学附属第一医院消化内科，辽宁 沈阳 110001

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种常见疾病，目前除了肥胖、高脂血症、糖尿病及胰岛素抵抗等危险因素外，遗传因素在其发病中起到的作用越来越受到重视。近期发现的TM6SF2 rs58542926 E167K单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与NAFLD的易感性明显相关，且有研究显示其与非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化及肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生同样相关。目前认为TM6SF2在体内参与肝细胞脂肪代谢，与极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)的分泌有关，TM6SF2 rs58542926 E167K突变导致该蛋白功能丧失，引起肝脏甘油三酯(triglyceride,TG)的过度积累，导致NAFLD的发生。

非酒精性脂肪性肝病；TM6SF2 rs58542926 E167K；单核苷酸多态性；易感性

目前认为非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病与肥胖、高脂血症、糖尿病及胰岛素抵抗有关，有研究[1]认为，NAFLD是全身代谢综合征在肝脏的一种表现。NAFLD的典型病理表现为肝脏中过量甘油三酯(triglyceride,TG)蓄积，并出现脂滴。但是肝脏TG的聚集在不同个体间有明显差异，且NAFLD的发病具有明显的家族聚集性[2]，有研究[3]显示脂肪肝的遗传概率为26%～27%，人们开始重视遗传因素在此过程中的作用。随着全基因组关联分析(genome-wide association studies，GWAS)在疾病研究中的应用，人们意识到NAFLD与肥胖、高血压病、2型糖尿病、心血管疾病等一样，是由危险因素(肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗等)与易感基因相互作用并最终导致疾病的发生[4]。遗传因素不仅影响个体对疾病的易感性，且可能影响其疾病的发展及预后。

1 NAFLD相关GWAS研究最新进展

2008年Romeo等[5]首次通过GWAS方法，在9 229名不同人种的参与者中发现PNPLA3 rs738409单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与NAFLD的易感性有极大相关性，随后的研究[6-8]证明，PNPLA3 rs738409 I148M SNP不仅影响NAFLD的易感性，且对NAFLD是否进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌产生显著影响。此后相继报道的可能影响NAFLD易感性的基因包括：NCAN、PPP1R3B、GCKR、LYPLAL1、CDKN1A等[8-11]。

2014年Kozlitina等[12]首次报道了TM6SF2(transmembrane 6 superfamily member 2)rs58542926 E167K SNP与NAFLD易感性的相关性。他们通过GWAS方法，在验证了PNPLA3 rs738409 I148M SNP与NAFLD易感性相关的基础上，在TM6SF2基因上找到与NAFLD易感性相关的新的SNP：TM6SF2 rs58542926 E167K，随着对TM6SF2基因研究的逐渐深入，TM6SF2 rs58542926 E167K SNP与NAFLD发生、发展的相关性逐渐受到人们的重视。

2 TM6SF2的一般特性

TM6SF2于2000年首次被报道[13]。TM6SF2位于第19号染色体上，编码一段由351个氨基酸构成的蛋白，据估计其蛋白结构是由7个跨膜功能域组成的，但均与目前已发现的具有功能的功能域不同。TM6SF2主要在脑组织、肾脏、肝脏及小肠表达，其中在小肠组织表达最高[12]。与TM6SF2基因连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)程度很高的NCAN基因被报道与脂肪代谢有关[14]。

TM6SF2 rs58542926 E167K SNP在欧洲人种中次要等位基因频率(minor allele frequency，MAF)最高(7.2%)，高于非裔美国人(3.4%)及西班牙人(4.7%)[12]，在中国香港人中携带率为7.0%[15]，与在中国大陆人群中的携带率(6.6%)相当[16]。

TM6SF2上的rs58542926 SNP导致第499号核苷酸由胞嘧啶(cytosine，C)突变为胸腺嘧啶(thymine，T)的替代突变导致第167残基由谷氨酸突变为赖氨酸(rs58542926 c.499 C>T，p.Glu167Lys，E167K)，进而影响由其编码的蛋白质的功能[17]。在HuH-7肝癌细胞中分别表达TM6SF2的野生型(167E)及突变型(167K)后发现，野生型及突变型的TM6SF2 mRNA的表达数量是相当的，但突变型TM6SF2蛋白量仅是野生型TM6SF2蛋白量的46%。由此猜测，TM6SF2突变型蛋白由于表达异常导致在细胞内加速降解，进而导致突变型蛋白量的减少[12]。

3 TM6SF2 rs58542926 E167K与血脂异常的关系

Kozlitina等[12]通过达拉斯心脏研究(Dallas Heart Study，DHS)，检测了2 763名参与者的138 374个序列与肝脏TG含量的关系，发现TM6SF2 rs58542926 T等位基因携带率与肝脏TG含量显著相关，还发现TM6SF2 rs58542926 E167K突变与血浆TG、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)水平的下降有关，与血浆高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterin，HDL-C)水平无关。

为了验证这一结果，Kozlitina等[12]利用导入腺病毒载体特异地降低小鼠肝脏TM6SF2基因转录的方法，研究TM6SF2基因在肝脏脂肪代谢中的作用，结果发现小鼠体内肝脏TG含量升高了3倍，血浆胆固醇水平显著下降，血浆TG水平也呈下降趋势；而TM6SF2 167E基因过表达，肝脏TG含量显著下降，血浆LDL-C含量升高。敲除TM6SF2 167E基因后产生的肝脏TG含量升高及血浆胆固醇、及TG含量降低的结果，是否说明TM6SF2 167E基因在体内有参与分泌极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)的功能呢？为了验证这一猜想，Kozlitina等[12]抑制血管内脂蛋白酶活性并检测血浆中VLDL累积的速率，结果发现TM6SF2 167E基因敲除小鼠体内VLDL累积速率显著降低。由此得出结论，TM6SF2 167E基因在体内的确参与VLDL分泌，而TM6SF2 167K导致的肝脏TG含量升高与TM6SF2蛋白功能丧失有关。

Holmen等[18]在C57BL/6J小鼠体内进行Northern blotting及Western blotting检测发现，内源性TM6SF2 mRNA及蛋白在小鼠肝脏高度表达。通过在C57BL/6J小鼠体内使TM6SF2基因过表达，观察到血浆总胆固醇(TC)、LDL-C及TG水平均有所升高(TC：2.3倍，P=9×10-4；LDL-C：5.8倍，P=4×10-4;TG：1.13倍，P=0.031)，而HDL-C水平则有所下降(0.45倍，P=9×10-4)；而敲除TM6SF2基因则引起血浆TC较正常对照降低了18.2%(P=0.013)，因此考虑TM6SF2基因的功能与血脂水平调节有关，更具体地说，TM6SF2基因变异可能会引起肝脏脂蛋白水平升高，这与Kozlitina等[12]的实验结果一致。

Mahdessian等[19]利用共聚焦显微镜进行亚细胞定位，观察到TM6SF2蛋白定位于肝细胞的内质网(endoplasmic reticulum，ER)及ER与高尔基体的间隔(the ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)上，并利用在Huh7、HepG2肝癌细胞中过表达、敲除TM6SF2基因的方法，比较其表达水平变化产生的生物学效应。结果表明，敲除TM6SF2基因可导致甘油三酯脂蛋白(TG-rich lipoproteins，TRLs)的分泌减少，使血浆中TG浓度降低，肝细胞TG含量升高，肝脏脂滴大小及数量增加，与之相对，TM6SF2基因过表达可导致TRLs分泌增加，使血浆中TG浓度升高，肝细胞TG含量降低，脂滴大小及数量减少。据此推测TM6SF2基因与肝细胞低密度脂蛋白及TG的分泌有关，TM6SF2基因突变引起分泌功能下降，导致肝脏脂蛋白蓄积增加。且实验结果与Kozlitina等[12]及Holmen等[18]相一致。

4 TM6SF2 rs58542926 E167K与肝酶异常的关系

TM6SF2 rs58542926 E167K突变(EK/KK)可引起血浆丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)含量显著升高(P=0.003)，突变纯合子(KK)有引起血浆天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)升高的趋势[12]，这点与PNPLA3 I148M相似，PNPLA3 I148M可引起肝脏TG含量及ALT显著升高[3]，且PNPLA3 I148M是目前被证明与NAFLD易感性相关的唯一突变，并与NAFLD的进展有关。

TM6SF2 E167K并未观察到与谷氨酰转肽酶(gamma glutamyl transpeptidase，GGT)有明显关联，但可以引起血浆碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)显著下降。TM6SF2基因在人体小肠组织中表达最高，小肠从食物中吸收TG蛋白，即乳糜微粒，ALP同样在小肠表达。TM6SF2 E167K引起血浆ALP下降，这可能与小肠组织中TM6SF2 E167K突变有关[12]。Kaliannan等[20]发现清除小鼠小肠内ALP后可以诱导小鼠产生代谢综合征。TM6SF2 E167K是否可以通过引起ALP下降从而影响脂肪代谢、进而增加肝脏TG含量、影响NAFLD的发生仍有待进一步研究。

5 TM6SF2 E167K与NAFLD的关系

Liu等[17]在349例NAFLD患者中检测到TM6SF2 E167K的MAF为0.12，显著高于由265名白人组成的正常对照组(MAF=0.07)及北欧人群正常对照组(MAF=0.07)，且在由NAFLD的患者组成的实验组(n=349)和验证组(n=725)中发现TM6SF2 E167K等位基因的携带数量与NAFLD发病率相关(P=0.0008)。

Sookoian等[21]在226例NAFLD患者组成的实验组及135名正常参与者组成的对照组中检测发现，对照组中C(Glu167)等位基因及T(Lys167)等位基因携带率分别为94.5%、5.5%，而所有参与者的C(Glu167)、T(Lys167)携带率分别为91.4%、8.6%。通过离散性状分析(discrete trait analysis)发现，TM6SF2 E167K与NAFLD的发病相关(P=0.038，OR=1.37，95%CI：1.02～1.84)。

Wong等[15]通过分别检测384例NAFLD患者及384名正常人中TM6SF2 167K的携带率，发现TM6SF2 167K突变与NAFLD易感性明显相关(P=0.0007)，从而证明在中国汉族人口中，TM6SF2 rs58542926 E167K SNP与NAFLD的易感性同样相关。Pirola等[22]通过Meta分析发现TM6SF2 rs58542926 E167K与NAFLD的发生相关。

6 TM6SF2 E167K与脂肪变性的关系

Liu等[17]在349例NAFLD患者组成的实验组中，比较TM6SF2 E167K对肝脏细胞脂肪变性的影响，发现TM6SF2 E167K与肝细胞脂肪变性的程度无明显关系(β=0.087±0.083，95%CI：0.076～0.025，P=0.296)，在该研究中由725例NAFLD患者组成的验证组中得到了同样的结论。但将实验组和验证组合并后(n=1 074)，TM6SF2 E167K与肝细胞脂肪变性显示出有关联的趋势(β=0.111±0.059，95%CI：0.0041～0.2268，P=0.554)，尤其是将肝细胞脂肪变性的程度按照轻度(S0-1)及重度(S2-3)进行分组后，这种影响变得更加明显(OR=1.379，95%CI：1.019～1.865，P=0.037)，由此得出结论，携带TM6SF2 E167K等位基因与肝细胞脂肪变性的严重程度可能相关。Sookoian等[21]的研究得出与Liu等[17]一致的结论，携带TM6SF2的T等位基因(EK/KK)与肝细胞脂肪变性明显相关(β=0.15，P=0.0299)。

7 TM6SF2 E167K与非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)的关系

Liu等[17]通过综合分析肝脏组织学坏死性炎症及肝细胞气球样变性的情况研究TM6SF2 E167K与NASH的关系，与性别、年龄、体质量指数(body mass index，BMI)、2型糖尿病、PNPLA3 rs738409等因素通过多变量分析发现实验组TM6SF2 E167K与NASH的严重程度有关(β=0.288±0.139，95%CI：0.015～0.561，P=0.039)。

然而Sookoian等[21]通过比较由NASH组成的实验组与NAFLD组成的对照组发现，携带T等位基因(EK/KK)并未对是否进展为NASH产生显著影响(OR=1.13，95%CI：0.58～2.20)，同时也未观察到携带T等位基因(EK/KK)与小叶炎症(OR=0.85，95%CI：0.60～1.20，P=0.34)或肝细胞气球样变性(OR=1.08，95%CI：0.78～1.50，P=0.64)有关联。TM6SF2 E167K是否与NASH具有相关性仍有待进一步研究。

8 TM6SF2 E167K与肝纤维化的关系

Liu等[17]通过分别检测均由NAFLD患者组成的实验组(n=349)、验证组(n=725)、混合组(n=1 074)中TM6SF2 E167K的携带率发现，T危险基因与肝纤维化的程度有关，且是独立于性别、年龄、BMI、2型糖尿病及PNPLA3 rs738409以外的危险因素，且携带T危险基因的数量与肝纤维化程度明显相关。

Dongiovanni等[23]在1 201例怀疑有NASH欧洲NAFLD患者中检测有188名TM6SF2 E167K携带者，该携带者表现出更严重的肝损伤，包括脂肪变性、坏死性炎症、气球样变，且更易进展为肝纤维化(OR=2.08)。

9 TM6SF2与肝细胞癌的关系

Liu等[17]通过检测99例NAFLD发展的肝细胞癌患者的TM6SF2 E167K的携带率，并与由1 074例NAFLD患者组成的对照组中TM6SF2 E167K的携带率比较，发现T危险基因显著影响NAFLD导致的肝细胞癌的发病率(OR=1.922，95%CI：1.31～2.81，P=6.81×10-4)，但当与年龄、性别、BMI、2型糖尿病及是否患肝硬化等因素进行多变量分析时，这种影响便消失了(P=0.42)，这种结果考虑与这个研究中肝细胞癌患者数量过少有关。因此，TM6SF2 E167K是否与NAFLD→肝细胞癌的发生率有关仍需进一步的研究。

TM6SF2在人体内的生物功能虽仍未被阐明，但目前普遍认为该基因表达的蛋白参与肝脏脂质代谢，TM6SF2 E167K突变将引起该蛋白功能丧失，引起肝脏TG含量增加、血浆胆固醇含量降低，进而导致NAFLD的发生，另一方面，由于引起血浆LDL含量降低对心血管疾病的发生起到保护作用[23]。有关TM6SF2 E167K突变引起肝脏脂肪代谢异常的分子机制仍需深入研究。

TM6SF2 E167K是否与PNPLA3 I148M一样，不仅影响NAFLD的易感性，且影响NASH、肝细胞癌的发生目前还没有定论，仍需要更为深入的研究。且目前有研究[24]发现PNPLA3 I148M是导致肝硬化及肝细胞癌发生的独立危险因素，TM6SF2 E167K是否具有同样的作用有待进一步研究。我国关于TM6SF2 E167K的研究目前仍不够深入，TM6SF2 E167K在我国人群中的携带率及是否与NASH、肝硬化及肝细胞癌的发生相关等问题仍需进一步研究。

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(责任编辑：王全楚)

The relationship between TM6SF2 rs58542926 E167K single nucleotide polymorphisms and the susceptibility of non-alcoholic fatty liver disease

ZHANG Shuang,LI Yiling

Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a common disease,which is absolutely associated with features of the metabolic syndrome,including obesity,dyslipidaemia,type 2 diabetes mellitus (T2DM) and glucose intolerance. Much ongoing research is focused on identifying the genetic factors which contribute to NAFLD pathogenesis. Recently,TM6SF2 rs58542926 E167K single nucleotide polymorphisms (SNPs) are demonstrated to be associated with NAFLD,the morbidity of nonalcoholic steatohepatitis (NASH),cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). TM6SF2 is required for very low-density lipoprotein (VLDL) secretion and TM6SF2 rs58542926 E167K variant leads to lose the function of TM6SF2,which causally contributes to the attack of NAFLD.

Nonalcoholic fatty liver disease; TM6SF2 rs58542926 E167K; Single nucleotide polymorphisms; Susceptibility

张爽，硕士，硕士生导师，研究方向：非酒精性脂肪性肝病的基础与临床。E-mail：1209611093@qq.com

李异玲，博士，主任医师，教授，研究方向：非酒精性脂肪性肝病的基础与临床。E-mail：lyl-72@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.002

R575.5

A

1006-5709(2016)04-0367-04

2015-12-01