李凡飞,张 云,李 强,赵泽慧,何小丽,许立华*

(1.宁夏大学农学院， 宁夏银川 750021;2.宁夏大学后勤集团医保中心，宁夏银川 750001)

文献综述

C型产气荚膜梭菌致病机理研究进展

李凡飞1,张 云2,李 强1,赵泽慧1,何小丽1,许立华1*

(1.宁夏大学农学院， 宁夏银川 750021;2.宁夏大学后勤集团医保中心，宁夏银川 750001)

C型产气荚膜梭菌能够引起人类和一些动物的坏死性肠炎。该菌能产生α外毒素和β外毒素，大部分该菌菌株也能分泌出产气梭菌细胞溶素O(PFO)和TpeL。试验证明β外毒素是C型产气荚膜梭菌的主要致病毒素。在兔子肠襻和小鼠模型试验中发现，通过细胞中同源基因C型产气荚膜梭菌β毒素敲除基因突变株而导致该菌株失去毒力。当野生型β毒素基因补充这些突变体时毒素的活力将会复活。大多数C型产气荚膜梭菌产生的所有毒素(除TpeL外)都易与肠癌(Caco-2)细胞紧密结合并发生反应，比它在体外生长更加迅速。VirS/virR双组分调节系统(TCRS)被证明是在Coca-2细胞中导致β毒素和PFO产生快速上调。当virR基因被抑制时，pfoA和β毒素基因的表达也会受阻，这种系统是可逆的，virR表达时会恢复。通过β毒素作用于动物模型的试验研究，来寻找有效的预防措施。

C型产气荚膜梭菌；β毒素；致病机制；坏死性肠炎

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一种革兰阳性厌氧杆菌，根据它产生的4种主要毒素(α、β、ε、ι)的不同而分为A、B、C、D、E共5种血清型[1]。产气荚膜梭菌部分菌株也能产生其他毒素(肠毒素、β2毒素和产气梭菌细胞溶素O)，但这些毒素并没有用于这个微生物的分类。该菌能引起大多数哺乳类动物的胃肠道感染，由于肠内不仅能产生毒素而且能吸收毒素进入机体循环，因此这种传染病通常被称为肠毒血症。但是，产气荚膜梭菌产生的一些毒素是在肠内产生且作用于肠内细胞，然而也有一些毒素在肠内和机体都能产生致病作用[2]。

C型产气荚膜梭菌能引起一些家畜和人类的肠毒血症。人自然感染C型产气荚膜梭菌的临床症状、组织病变方面与大数动物相同。该病根据病程分为最急性、急性和慢性3种。最急性和急性的特征是腹部疼痛、精神抑郁和腹泻带血；慢性疾病发生在一些成年动物(羊和马等)，临床症状为顽固性腹泻、粪便不带血和脱水。尸体剖检时，主要在病体的小肠上发生病变，但盲肠和结肠也会出现；其他组织与肠的各段具有相似的病变。最急性症状中肉眼可见的病变包括弥漫性、阶段性、广泛坏死性和出血性肠炎并伴随水肿。在急性和亚急性病例中通常能观察到伪膜性结肠炎。在组织结构上，C型产气荚膜梭菌病的肠壁上会出现出血性坏死，先是感染黏膜层然后会侵袭肠壁的所有层膜。纤维蛋白血栓能堵塞表面动脉和固有层静脉并且黏膜下层有条件性特征[3]。C型产气荚膜病能引起人类的坏死性肠炎，该病在东南亚地区零星性发生，在新几内亚通常呈地方流行性[4-5]。该病在糖尿病患者多的地区较容易流行。人患有坏死性肠炎时，往往会在临床症状开始出现的48 h内死亡[6]。迄今为止，C型产气荚膜梭菌的致病机制也是研究甚少。

1 β毒素

C型产气荚膜梭菌各种毒素的主要特征：α毒素的分子质量为42.528 ku，对鼠的半数致死量(LD50)为3 μg/kg，能引起致死性、坏死性和溶血性的症状，耐热但对胰岛素比较敏感；β毒素的分子质量为35 ku，对鼠的半数致死量为1.8 μg/kg，能引起水肿症状，60℃下失活、在-80℃下能保存2个月左右，并且在胰岛素作用下易失活；CPE分子质量为35 ku，对鼠半数致死量为50 μg/kg，易导致水肿和致死性肠炎，在60℃1周内失活、-20℃保存1月左右，胰岛素能激活CPE的活性；β2毒素的分子质量为28 ku，对鼠的半数致死量为0.3 μg/kg，也可为引起水肿症状但它的耐热性还未知，对胰岛素敏感。该菌至少会产生α毒素和β毒素，其他毒株也会产生肠毒素(CPE)、β2毒素、PFO、TpeL等毒素。但是，当前的研究证明β毒素是C型产气荚膜梭菌病的主要致病因子，β毒素是一个35 ku蛋白质并在敏感细胞膜上形成孔道，这样会导致细胞水肿和溶解。

β毒素对小鼠的半数致死量(LD50)是1.87 μg/kg，毒素是在小鼠的腹腔进行注射。β毒素基因编码了一条336个氨基酸的强亲和力毒素，在分泌期间有一段27个氨基酸的信号序列被拆掉，结果产生一个约为25 ku的突变毒素。纯化的β毒素是不耐热的，在50℃条件生长1 h将失去该毒素90%的致病毒性。β毒素对胰蛋白酶和胃蛋白酶也会有较高敏感性，但在低pH下似乎并不影响该毒素的活性。

通过对C型产气荚膜梭菌病的调查，发现β毒素是该病诱发的基础分子，先前的试验叙述β毒素能在衍生白色细胞HL-60和人白血病细胞的细胞膜上成孔形[3]。重组毒素研究也证明β毒素在磷脂双分子膜上有形成孔道的能力，孔径为12Å。这些通道可以选择性的使一些离子通过，如引起K+外流和Ca2+、Na+、Cl-涌入，这可以导致细胞肿胀和溶解[7]。如果将212位的精氨酸残基用天冬氨基酸替代，其毒性会下降，对小鼠的半数致死的剂量将会增长13倍，也极度减弱了β毒素形成孔道的能力。在豚鼠的皮肤上注射小剂量的β毒素将产生皮肤坏死，也可以引起水肿和浆液性渗出。这种毒素也引起TNF-α和IL-1β的释放和速激肽NK1受体的激活，目前其诱导机制还有待进一步研究[8]。

Schafer K W等[9]发现β毒素在引起的人和仔猪的急性病例中，毒素与肠黏膜的血管内皮细胞特异性结合。因此，β毒素与内皮细胞的结合引起了上皮细胞坏死是产气荚膜梭菌β毒素引起的肠炎的初期症状。在疾病的后期阶段，当发展为大面积的肠道黏膜坏死时，小肠微血管内血栓的形成可以作为病变的特征。

2 β毒素的基因遗传和其生产调控

β毒素基因编码β毒素是在具有毒力的大质粒上，该质粒的大小是65 kb～110 kb。该基因也编码出TpeL，是一种梭菌性细胞毒素，在β质粒上也能编码出CPE[2，4]。B型和C型产气荚膜梭菌中关于β毒素的复制和测序，与1 000 bp的ORP非常相似[10]。尽管已经知道β毒素在C型产气荚膜梭菌病的重要性，却对β毒素基因的调控作用相对了解较少。研究表明，无论是在厌氧还是需氧的条件下，β毒素在人结肠腺癌细胞Caco-2细胞中的产生都迅速上调。VirS/VirR双组分调节系统(TCRS )被证明是在Caco-2细胞中生产过程中控制早期β毒素基因转录的上调[2]。上述研究报道了Caco-2细胞导致毒素的快速分泌的，标志着Caco-2细胞对宿主梭菌的优先识别会影响经典外毒素的生产，这是梭菌传染病的特点。这种现象在C型产气荚膜梭菌中广泛存在，从病人和一些不同种类动物中分离出来产气荚膜梭菌的其他菌株，它们的毒素也在人结肠腺癌细胞Caco-2细胞中的产生迅速上调[11]。

3 C型产气荚膜梭菌的致病机制

C型产气荚膜梭菌病是由于该菌先在肠道内繁殖并产生毒素引起的，其中β毒素就是最重要的致病毒素。C型产气荚膜梭菌在一些动物的肠内是一个共生体，它真正进行传染不是其中一种菌作用而是至少几种菌共同作用。但是，有关正常动物体内C型产气荚膜梭菌带菌率的信息比较缺乏。C型产气荚膜病中β毒素的第一靶点在宿主肠道上，这里的毒素具有较高的活性。对肠上皮细胞的破坏，可以通过β毒素的直接作用也可以间接作用，通过血栓形成和肠道缺血引起的肠内皮细胞的破坏[12]，允许β毒素和其他毒素能传入体内循环系统而引发致死作用。一些动物模型通常被用来研究C型产气荚膜梭菌传染病，其中包括小猪、豚鼠、兔、小鼠、绵羊和山羊。试验性仔猪和豚鼠最初被广泛用于研究C型产气荚膜梭菌病的致病机理[13]。

试验证明β毒素是由C型产气荚膜梭菌提供的最重要毒力因子，也证明了用β类毒素疫苗进行免疫，能够确保人和动物不被C型产气荚膜梭菌感染[1，14]。也有试验证明纯化的β毒素对小鼠有较高的致病力。Fisher等通过鼠静脉注射法统计致死率的试验，证明了β毒素是重要的致病因子并在对数生长后期的培养上清液中存在。这个试验说明了C型产气荚膜梭菌的培养上清液和纯化的β毒素能引起试验鼠死亡，对含有β毒素单克隆抗体而不含α毒素抗体的液体进行预培养能降低致死率[7，15]。通过这些试验可以确认β毒素的毒力在诱导性致死方面存在特异性。

最新的一些报道以兔肠襻为模型，进行一系列C型产气荚膜梭菌毒素敲除突变体的检测试验。在这些试验中，C型产气荚膜梭菌野生型CN3685片段在对数生长后期营养繁殖的培养物能引起兔肠襻出血坏死性肠炎[16]。同基因毒素敲除突变体是准备使用TargeTron技术把该毒素接种于兔肠襻，即使一个双基因cpa/pfoA敲除CN3685的突变体但还会具有致病力[17]。但是，敲除两个独立的β毒素基因突变体，该毒素将会对动物模型完全失去毒力。如果β毒素突变基因逆转将恢复β毒素产生和对肠道的致病力，证明了科赫的分子学假设。这些结果证明了CN3685基因能诱发肠炎，该毒素在C型产气荚膜梭菌致病性上发挥重要的作用[13]。

纯化的β毒素在胃肠道的不同部位所产生的毒素效应也有所不同，在十二指肠、空肠、回肠能够观察到出血和组织损伤。但是，十二指肠对β毒素的敏感性比空肠和回肠低，并且结肠是不受影响的[18]。这些部位对β毒素存在敏感性差异能为阐述C型产气荚膜梭菌对胃肠道的影响提供重要依据，即该菌主要侵袭人和动物的空肠和回肠。胰腺分泌的大量胰蛋白酶主要存在于十二指肠内，β毒素对胰蛋白酶较为敏感，从而减弱了β毒素的活性，因此降低了C型产气荚膜梭菌自然感然病例的发生。尽管有些研究报道显示，在C型产气荚膜梭菌自然感染和试验性感染中，β毒素的致病作用在结肠不受影响，但也有关于人C型产气荚膜梭菌病中结肠损伤的一些报告。除β毒素外，其他的一些该菌毒素在结肠内也存在活性或者物种的差异，导致β毒素在结肠内的敏感性的不同，这些可能性还需要持续的试验加以验证。但是C型产气荚膜梭菌分泌的其他毒素(如CPE与β毒素相似)对兔结肠襻没有损伤[19]。在动物体外和体内的试验发现结肠内有限制该毒素活性的物质[20]。

对C型产气荚膜梭菌自然感染病例的研究表明，β毒素的致病性不仅是引起肠道病变，而且肠道还能吸收该毒素并能进入体内循环系统从而侵袭远端的器官(大脑)[14]。利用两个小鼠模型(胃型和十二指肠型)，分别用野生型菌株CN3685接种，以研究C型产气荚膜梭菌的致病性及小鼠体内各系统的变化。结果显示，在C型产气荚膜梭菌自然感染小鼠的模型中，临床症状表现为抑郁、腹部肿胀、呼吸困难和神经症状，最终引起死亡。但是，在任何一个小鼠模型中并没有观察到腹泻和肠道异常。试验小鼠缺乏明显症状和小肠病理组织学变化，可以反映出小鼠肠道上皮细胞和内皮细胞上缺少β毒素受体[21]。尽管之前关于β毒素的神经系统效应仅是猜测，Fisher 等人研究发现通过对小鼠静脉接种β毒素后可观察到神经系统的改变。而且，当接毒之前β毒素和抗β毒素mATB混合培养一段时间，这些临床症状将会消失。当小鼠的胃和十二指肠内受到C型产气荚膜梭菌菌株和纯化β毒素的侵袭时，可观察到神经病变症状，但在小鼠的肠道内没有观察到组织病变，除了坏死性肠炎产生的其他毒素被吸收而引起的非特异性效应。这些研究结果确认β毒素能引起神经系统病变，但β毒素产生神经性症状及病理变化的致病机制仍需进一步研究。

当同基因CN3685毒素敲除突变体被接种于鼠的胃或十二指肠模型时，由于β毒素编码基因的失活，使呈高致病性C型菌株CN3685对鼠胃模型没有毒性而且对鼠肠模型几乎没有致病性。相反，编码α毒素或PFO基因的失活仅仅略有降低CN3685的致病力[19]。对提前经静脉注射含有β毒素抗体的小鼠进行野生型菌株CN3685的接种[22]，能抵抗细菌对胃的致病力。这些结果证明了C型产气荚膜梭菌β毒素在该菌致病性上起着重要的作用。

4 讨论

C型和B型产气荚膜梭菌主要产生β毒素，该毒素是引起人和动物患坏死性肠炎和肠毒血症的主要毒力因子。另外，研究β毒素作用的动物试验模型，也为该病提供了新的预防方针和治疗方法。但是β毒素的作用机制还需进一步在分子水平和细胞水平来阐述β毒素的反应机理和影响β毒素毒力的主要因素。在C型产气荚膜梭菌感染过程中，β毒素通过与特异性受体精准结合后方可发挥其致病性，这就启发我们可以设计特殊的毒素抑制剂或者制造经过修饰的特异性毒素分子，其中包括C型产气荚膜梭菌产生的一个或多个强力的毒素。产气荚膜梭菌纯毒素作用和研究方法的最新进展之一，是提供失活的毒素基因作为非常有用的方法去研究产气荚膜梭菌的几种毒素在动物和人梭菌病中发挥的作用[23]。这些方法使我们认识梭菌毒素如何介导细胞且产生损伤的。这些有价值的研究方法在该领域变得非常重要并且能继续帮助研究者：①确认β毒素在引发动物疾病中的作用；②调查动物体内毒素的作用机制；③开发更有效的疫苗,预防产气荚膜梭菌所引发的致命疾病；④研究Virs/VirR双组分调节系统的作用以及机体感应机制。

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Progress on Pathogenesis Mechanism ofClostridiumperfringensType C

LI Fan-fei1, ZHANG Yun2, LI Qiang1, ZHAO Ze-hua1, HE Xiao-li1， XU Li-hua1

(1.SchoolofAgricultureNingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia, 750021,China；2.HealthCareCenterofNingxiaUniversityLogisticsGroup,Yinchuan,Ningxia,750001,China)

Clostridiumperfringenstype C causes necrotizing enteritis in humans and some animal species. Type C isolates produce beta toxin (CPB) and alpha toxin (CPA) and most strains produce several other toxins including perfringolysin O (PFO) and TpeL. However, current evidence indicates that CPB is the main virulence factor for type C infections. The rabbit intestinal loop and mouse model experiments showed thatC.perfringenstype C toxin β gene knockout mutant strain caused the loss of virulence, and the virulence was regained when these mutants were complemented with the wild-type cpb gene. Many type C isolates respond to contact with enterocyte-like Caco-2 cells by producing all toxins, except TpeL, VirS/VirR two-component regulation system (TCRS) proved rapid Caco-2 cell-induced upregulation of CPB and PFO production. The upregulatedinvivotranscription of the pfoA and cpb genes was blocked by inactivating the VirR gene,and was reversible by restoring VirR expression. The animal mode experimental research of beta toxin may find effective precautionary measures.

Clostridiumperfringenstype C; beta toxin; pathogenesis; necrotizing enteritis

2016-06-08

宁夏“优质高产奶牛遗传改良与选育”专项(2013NYYZ0501)

李凡飞(1991-),男,河南商丘人,硕士，主要从事预防兽医学研究。 *通讯作者

S852.615

A

1007-5038(2016)12-0082-04