陈丽妃，徐　帆，黄　慧，赵　昕，钟海彬，李　敏



·临床研究·

原发性闭角型青光眼血浆同型半胱氨酸水平及其代谢相关指标的检测分析

陈丽妃，徐帆，黄慧，赵昕，钟海彬，李敏

Citation:Chen LF,Xu F, Huang H,etal. Detection and analysis of plasma homocysteine levels and its metabolism related indicators in patients with primary angle-closure glaucoma.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(6):1092-1095

摘要

目的：探讨同型半胱氨酸水平及其代谢相关指标与原发性闭角型青光眼的关系。

方法：选取150例经压平眼压计、Humphrey 视野计(HVF)、光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)、房角镜等检查确诊为原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,PACG)的患者作为试验组和同期150例我院体检中心健康者为正常对照组，抽取空腹外周静脉血，而后测定血浆中同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)浓度、维生素B12及叶酸的浓度，并提取DNA，检测Hcy代谢途径中关键酶——亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR) C677T的基因型及基因多态性。

结果：试验组血浆中Hcy的浓度为16.11±1.66μmol/L，正常对照组为15.74±1.52μmol/L，两组比较，差异有统计学意义(t=2.04，P=0.04)。试验组血浆中维生素B12的浓度为248.09±119.07pg/mL，正常对照组为230.21±142.93pg/mL，两组比较差异无统计学意义(t=0.84，P=0.40)。试验组血浆中叶酸的浓度为12.02±7.81ng/mL，正常对照组为13.15±6.25ng/mL，两组比较差异无统计学意义(t=1.65,P=0.17)。试验组MTHFR C677T基因型(CC、CT、TT)分布频率分别84.7%、4.7%、10.7%，正常对照组分别为94.7%、2.0%、3.3%，两组基因型分布频率差异具有统计学意义(χ2=6.2，P<0.05)；其中试验组MTHFR基因TT纯合子的分布频率高于正常对照组；试验组MTHFR基因T、C等位基因频率分别为87.0%、13.0%，正常对照组为95.7%、4.3%，两组差异具有统计学意义(χ2=14.2，P<0.05)。

结论：PACG患者血浆中Hcy的浓度及MTHFR基因型TT纯合子的分布频率高于正常对照组，说明高Hcy水平及其代谢相关因素可能与PACG的发病与发展密切相关。

关键词：同型半胱氨酸；维生素B12；叶酸；MTHFR C677T；原发性闭角型青光眼

引用：陈丽妃，徐帆，黄慧，等.原发性闭角型青光眼血浆同型半胱氨酸水平及其代谢相关指标的检测分析.国际眼科杂志2016;16(6):1092-1095

0引言

青光眼是世界范围内第一位不可逆致盲性眼病，其病理学基础是视网膜神经节细胞的凋亡，及在此基础上导致的特征性视神经结构和功能损害。青光眼视神经损害的发病机制复杂，目前认为主要有眼压升高的机械压迫学说和血管病变的缺血学说。视网膜视神经血管在高眼压作用下，其自我调节功能会发生障碍，进而导致视网膜和视神经的缺血。近年来研究发现，血清同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)水平升高会导致血管病变[1]，其与眼部血管病变及青光眼视神经损害的发生和发展也有一定关系[2-3]。为此我们对一组原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,PACG)患者血浆Hcy水平及参与Hcy代谢的维生素B12和叶酸，以及表达Hcy代谢关键酶——亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenterahydrofolate reductase,MTHFR)的基因多态性进行检测，旨在进一步探讨PACG患者血浆Hcy水平的变化，以及导致PACG患者血浆Hcy变化的可能机制和意义，现总结如下。

1对象和方法

1.1对象PACG的诊断标准：(1)具有青光眼性视盘损害和(或)视神经纤维层缺损；(2)青光眼性视野缺损；(3)前房角镜检查显示前房角为闭角[4]。本研究中试验组主要纳入标准：房角狭窄或关闭，无其他继发性因素；眼底有典型的青光眼性视乳头凹陷、萎缩；具有不同程度的青光眼性视野缺损。正常对照组纳入标准为：无眼部疾病史(屈光不正、白内障或斜视除外)；眼底视盘正常；眼压小于21mmHg。试验组及正常对照组排除标准：研究对象间有亲缘关系；严重影响体内血管的疾病，例如血栓、严重肾、肝、胃肠和神经系统疾病，高血压、糖尿病、心脏病，自身免疫性疾病，风湿性关节炎，类风湿关节炎；服用维生素或激素或其他已知的影响Hcy浓度的药物，例如抗抑郁药、多巴胺类药物、卡马西平、苯妥英钠、贝特类、他汀类药物、抗菌药物。本研究遵循ARVO宣言和医院伦理委员会批准。依据PACG诊断标准及本研究的纳入标准和排除标准，收集2013-12/2015-10在我院经Topcon裂隙灯显微镜、Topcon检眼镜、Nidek SL-20压平眼压计、Ocular房角镜、Zeiss Humphrey视野计(HVF)、Topcon光学相干断层扫描仪(optical coherence tomography，OCT)等检查确诊为原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma, PACG)的患者150例作为试验组，其中男73例，女77例，年龄41～87(平均61±13.53)岁。选取同期来我院体检中心体检的健康人150例为正常对照组，其中男74例，女76例，年龄45～86(平均61±9.42)岁。两组间研究对象的年龄及性别差异无统计学意义。

1.2方法

1.2.1标本搜集禁食10h后，在肘正中静脉抽取空腹静脉血2mL标本3份，并迅速采取抗凝、避光、低温处理。于30min内，送实验室采用2000r/min离心10min，取上清夜，并于-80℃保存，等待下一步检测。

1.2.2试验方法利用循环酶法测定Hcy浓度，具体检测方法如下:于清晨空腹抽取静脉血2mL，置于促凝管中，常温下离心分离血清，并立即送检，采用全自动生化分析仪及其配套试剂检测Hcy。利用化学发光免疫方法检测两组间叶酸、维生素B12浓度，具体检查方法如下：在专用拇指管中加入150μL血液样本，依次加入50μL裂解液和300μL沉淀剂，充分振荡30s至变色，然后11000r/min离心7min，上清液倒入样品杯中。肝素抗凝血以3500r/min离心10min，取500μL血浆放入样品杯中。运行化学发光免疫分析仪，依次加入处理好的样本，设置系统参数。运行系统，读取数据并记录。利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测MTHFR基因型，具体检测方法如下：吸取EDTA抗凝管中外周静脉血200μL至1.5mL离心管中，加入20μL Proteinase K,混匀。加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃水浴箱中放置10min,期间颠倒数次，溶液变清亮。加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，13400g离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，13400g离心30s，倒掉收集管中的废液。向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，13400g离心30s，倒掉收集管中废液。重复操作步骤6次。13400g离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数10min，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μL洗脱缓冲液TB，室温放置15min，13400g离心2min，将溶液收集到离心管中。所得DNA产物保存在-20℃。基因组DNA浓度测定。吸取2μL DNA样本，加入到198μL灭菌去离子水中，紫外分光光度计测量仪读取数值，重复测量，取平均值。应用PCR仪扩增大小约146bp的DNA片段。琼脂糖电泳，应用2.0%琼脂糖凝胶水平电泳检测PCR产物，在凝胶成像系统下观察电泳条带及Marker(MD101)相比位置是否正确和是否有非特异扩增。Hinf I酶酶切反应体系在最适温度37℃下水浴2h。取5μL酶切产物加0.5μL 6×Loading buffer上样缓冲液混匀后上样，电泳缓冲液为新配制的(0.5×TBE)：使用时加双蒸水稀释(5×TBE)缓冲液，室温下恒压120V电流320mA电泳30min。血浆中总Hcy浓度参考值为5.90～16.00μmol/L，叶酸正常范围参考值为2.00～16.00ng/mL，维生素B12正常范围参考值为191.00～663.00pg/mL。

1.2.3观察指标记录试验组及正常对照组的血浆中总Hcy、维生素B12及叶酸的浓度，MTHFR C677T的基因型。测量的方法、标准、人员一致，以免出现测量偏倚。

2结果

2.1两组血浆中总Hcy和维生素B12及叶酸的浓度试验组血浆中Hcy的浓度为16.11±1.66μmol/L，正常对照组为15.74±1.52μmol/L，两组比较差异有统计学意义(t=2.04，P=0.04)。试验组血浆中维生素B12的浓度为248.09±119.07pg/mL，正常对照组为230.21±142.93pg/mL，两组的差异无统计学意义(t=0.84，P=0.40)。试验组血浆中叶酸的浓度为12.02±7.81ng/mL，正常对照组为13.15±6.25ng/mL，两组比较差异无统计学意义(t=1.65,P=0.17)。

2.2两组MTHFR基因C677T多态性电泳结果MTHFR基因C677T经内切酶HinfⅠ消化及琼脂糖凝胶电泳后，呈现三种基因型，分别为纯合子野生型C/C、杂合子型C/T、纯合子野生型T/T。MTHFR基因C677T C/C、C/T和T/T基因型分布频率在试验组分别为84.7%(127/150)，4.7%(7/150)，10.7%(16/150)，正常对照组分别为94.7%(142/150)，2.0%(3/150)，3.3%(5/150)，两组之间的基因型频率分布差异有统计学意义(χ2=6.2，P<0.05)；MTHFR基因C677T C等位基因与T等位基因分布频率在试验组分别为87.0%(267/300)、13.0%(39/300)，正常对照组分别为95.7%(287/300)、4.3%(13/300)，两组之间的等位基因频率分布差异有统计学意义(χ2=14.2，P<0.05)。

3讨论

青光眼的发病与多种因素有关，比如房角解剖结构、年龄、性别、环境、基因遗传[5]。原发性青光眼根据房角解剖形态分为原发性闭角型青光眼和原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)，其中PACG是中国主要的青光眼类型[6]。我国PACG患病率高，预计至2020年患者将达到1 009万，约占世界PACG患者总数的48%[7]，这一数据冲击迫使我们把PACG作为我国重要的公共卫生问题。

青光眼视神经损伤的发病机制尚未完全明了。目前，青光眼的发病机制主要有两种学说，一种是机械学说，另一种是血管缺血学说。机械学说是一种比较公认的青光眼发病机制，强调的是高眼压对视神经的损害。近年来，越来越多的学者将研究方向转向了血管缺血学说，血管缺血学说中强调的是视网膜视神经血管调节障碍和相关代谢对视神经纤维的影响，降低视神经纤维及视神经对眼压的耐受力[8]。

大量研究表明，Hcy是公认的心脑血管疾病重要的危险因素之一[1]。此外，Hcy也是视网膜血管疾病的一个危险因素，比如视网膜中央静脉阻塞和视网膜中央动脉阻塞[2]；并且，环境和基因因素可引起血浆中Hcy浓度的改变。Hcy水平是否与原发性开角型青光眼的发病有关仍然存在争议，Johannes等的研究表明，Hcy的水平在原发性开角型青光眼患者的血浆中是升高的[9]；Laura等的研究表明Hcy与剥脱性青光眼(pseudoexfoliative glaucoma,PXG)的发生和发展有关，在PXG患者中，血浆Hcy水平升高；但是在原发性开角型青光眼和正常人中，血浆Hcy水平未见明显升高[10]。在本研究中，原发性闭角型青光眼的Hcy浓度为16.11±1.66μmol/L，正常对照组为15.74±1.52μmol/L，两组的差异较小，但差异仍具有统计学意义(t=2.04，P=0.04)。Hcy是可以反应视神经受损的敏感指标之一[11]，Hcy可以直接对青光眼患者的视神经结构产生损害作用，亦可通过对营养视网膜和视神经血管产生的影响，间接和青光眼性视神经损害发生关系。基于本次研究结果，在原发性闭角型青光眼中，除了高眼压对视神经有损害之外，Hcy的高水平在其发病及发展中可能是一个危害因素。

作为辅助因子的B族维生素(叶酸、维生素B12、维生素B6)是Hcy代谢途径中的关键因素。因我院未能行维生素B6的测定，故只测定叶酸及维生素B12的浓度。既往的研究表明，B族维生素的水平在各种类型的青光眼中是不一样的。Tongabay等的研究表明，维生素B12的浓度在剥脱性青光眼患者、原发性开角型青光眼患者、正常眼压性青光眼患者以及正常人血浆中的差异是无统计学意义的；叶酸的浓度在剥脱性青光眼患者血浆中较正常人是明显降低的，而在原发性开角型青光眼患者、正常眼压性青光眼患者中的浓度与正常人的相比，浓度相当，差异无统计学意义[12]。本课题研究的结果表明，维生素B12、叶酸虽然是Hcy代谢组的关键辅助因子，但是它们的水平差异在原发性闭角型青光眼患者和正常人中没有意义，说明Hcy的水平不受维生素B12和叶酸浓度的影响。

MTHFR是Hcy代谢途径中的关键酶，它催化从5，10-亚甲基四氢叶酸到5-甲基四氢叶酸的还原反应。C677TC-T突变是MTHFR基因中最常见的基因突变，不同的基因型可能会影响MTHFR的活性。宗永华等[13]在对241例的原发性高血压患者进行Hcy与C677T基因多态性关系的探索中发现，C677T基因多态性与Hcy和高血压关系密切，其中 C677T的纯合突变可能是Hcy升高和H型高血压重要遗传因素。Shazia等研究发现，在原发性闭角型青光眼患者中，C677T的多态性会降低MTHFR的酶活性，从而导致血浆中Hcy水平的升高[14]。在本研究中，MTHFR基因C677T C/C、C/T和T/T基因型分布频率在试验组分别为84.7%、4.7%、10.7%，正常对照组分别为94.7%、2.0%、3.3%，两组之间的基因型频率分布差异具有统计学意义(χ2=6.2，P<0.05)；MTHFR基因C677T C等位基因与T等位基因在实验组的分布频率分别为87.0%、13.0%，在正常对照组中分别为95.7%和4.3%，两组之间的等位基因频率分布差异有统计学意义(χ2=14.2，P<0.05)。结果说明了C677T的多态性会降低MTHFR的酶活性，致使血浆中Hcy水平的升高，从而导致PACG易感。研究结果与Micheal等的研究结果一致。

在本研究中，充分说明了Hcy水平及其代谢相关指标与原发性闭角型青光眼相关，其中，Hcy水平的升高和C677T的基因多态性与原发性闭角型青光眼的发病发展密切相关，高Hcy水平可以导致神经细胞死亡及氧化损伤，是原发性闭角型青光眼的危险因素之一。这提示我们，在控制青光眼的同时积极预防和治疗高Hcy血症是有效控制青光眼高发的重要措施。

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Detection and analysis of plasma homocysteine levels and its metabolism related indicators in patients with primary angle-closure glaucoma

Li-Fei Chen, Fan Xu, Hui Huang, Xin Zhao, Hai-Bin Zhong, Min Li

Foundation item:Guangxi Natural Science Foundation (No. 2012GXNST-AA276039)

Department of Ophthalmology, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region，China

Correspondence to:Min Li. Department of Ophthalmology, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region，China.limin00899@163.com

Received：2016-01-05Accepted：2016-05-05

Abstract

•AIM: To explore the relation of homocysteine (Hcy) and its metabolic related indicators with primary angle-closure glaucoma (PACG).

•METHODS: In this study, a total of 150 PACG patients and 150 controls were enrolled. The patients with PACG were diagnosed by applanation tonometer, Humphrey perimetry (HVF), optical coherence tomography(OCT), gonioscope. The normal controls were recruited from physical examination center. Blood samples were collected and the plasma was used to determine homocysteine, vitamin B12 and folic acid. DNA was extracted to determine the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677TT genotype and gene polymorphism.

•RESULTS: There was a statistically significant difference(t=2.04，P=0.04) in mean homocysteine levels between patients with PACG(16.11±1.66μmol/L) and controls(15.74±1.52μmol/L). The level of vitamin B12 in PACG group was 248.09±119.07pg/mL and the control group was 230.21±142.93pg/mL. No statistically significant difference was found on the vitamin B12 level between the two groups (t=0.84，P=0.40). The folic acid levels showed no statistically significant differences(t=1.65,P=0.17) between the PACG group(12.02±7.81ng/mL) and the control group(13.15±6.25ng/mL). The frequency distribution of the MTHFR C677T genotypes was found to be significantly associated (χ2=6.2，P<0.05) with PCAG (CC 84.7%, CT 4.7%, TT 10.7%) as compared to the controls (CC 94.7%, CT 2.0%, TT 3.3%). The frequency distribution of TT genotypes of MTHFR C677T in the PACG group was significantly higher than that in the control group. Moreover, our findings showed significant difference (χ2=14.2，P<0.05) between the allele frequency of the C677T single nucleotide polymorphism within the MTHFR gene in POAG patients(T 87.0%, C 13.0%) and the control group(T 95.7%,C 4.3%) .

•CONCLUSION: These results show that the Hcy level and the TT genotypes of MTHFR C677T were higher in the PACG patients than in controls. Therefore, our data suggests that high Hcy level and the related indicators are associated with high PACG risk.

KEYWORDS:•homocysteine; vitamin B12; folic acid; MTHFR C677T; primary angle-closure glaucoma

基金项目：广西自然科学基金项目(No.2012GXNST-AA276039)
作者单位：(530021)中国广西壮族自治区南宁市，广西壮族自治区人民医院眼科

作者简介：陈丽妃，女，毕业于广西医科大学，硕士，住院医师，研究方向：青光眼、眼底疾病。

通讯作者：李敏，女，毕业于广州中山医科大学，硕士，主任医师，眼科科主任，研究方向：青光眼、眼底疾病.limin00899@163.com

收稿日期：2016-01-05 修回日期： 2016-05-05

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.6.22