杨鹏飞　解景东　杨宝山



·综述·

基因治疗急性肝衰竭研究进展

杨鹏飞解景东杨宝山

急性肝衰竭(acute hepatic failure/ acute liver failure，AHF/ALF)是各种原因引起肝细胞坏死或大部分功能失常而导致肝功能衰竭的一种危重肝病的表现。临床上主要为急性起病，2周内出现Ⅱ度及以上肝性脑病(按Ⅳ度分类法划分)，并伴有以下表现[1]：①极度乏力，有明显厌食、腹胀、恶心、呕吐等严重消化道症状；② 短期内黄疸进行性加深；③出血倾向明显，血浆凝血酶原活动度(PTA)44%(或INR≥1．5)，且排除其他原因；④肝脏进行性缩小。作为一项全球性疾病，其病因包括病毒性肝炎、药物毒素中毒，遗传代谢障碍、自身免疫异常及隐源性等等。我国作为病毒性肝炎发生大国，肝炎及药物(含中草药)是导致急性肝衰竭的主要病因[2]。在欧美国家，对乙酰氨基酚和苯丙香豆素等化学合成类药物是引起急性、亚急性肝衰竭的主要病因。数据显示，在美国约50%的急性肝衰竭是由药物所引起[3,4]。最新流行病学调查显示，美国每10万人/年就有20例新发的因药物所致的肝衰竭[5]。急性肝衰竭一旦发生，其病情进展快，死亡率高，严重威胁着人们的生命健康。因此，如何对急性肝衰竭进行干预治疗，减少肝损害，提高生存率，改善预后，对提高公众健康具有重大的科学意义和社会实用价值。

一、急性肝衰竭的现有治疗方法

目前，对于急性肝衰竭的治疗主要集中在以下几个方面：药物综合治疗、细胞因子治疗(表皮生长因子EGF、血小板生长因子PLGF、促肝细胞生长因子HGF、前列腺素E1、肿瘤坏死因子TNF等)、人工肝治疗及肝移植等。现阶段，药物综合治疗和人工肝治疗仍然作为国内治疗的主要手段。国外则多以肝移植来治疗本病，其近期疗效明确而肯定，但远期疗效因受免疫排斥反应的制约而不容乐观。肝脏移植尽管可以有效改善患者的肝脏功能，但因受手术复杂性、器官来源以及受供者长期服用高额免疫抑制剂来避免排斥反应发生所造成的高昂药费和长期使用免疫抑制剂可能造成肾损害等因素的制约，限制了此疗法的开展。因此，寻找新方法提高肝细胞再生率、改善急性肝衰竭患者的预后，迫在眉睫。

二、基因治疗在急性肝衰竭治疗中的应用现状

基因治疗(gene therapy)的概念是由Szybalski等人在1962年通过发现Ca2+有刺激DNA转入细胞的作用而开启，由Nirenberg在1967年通过遗传工程作为治疗人类疾病的手段而引出，指的是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学技术。与常规治疗方法不同，基因治疗可针对疾病的根源——异常的基因本身进行治疗，因此在遗传病(如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等)、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病、类风湿等)等各类疾病的研究领域中，基因治疗均发挥了巨大的潜能和科研前景。在应用基因治疗进行肝衰竭的各项基础研究中，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点的间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)逐渐进入研究者的视野。早在1968年，Friendenstein等[6]首先发现在塑料培养皿中的贴壁非造血骨髓单核细胞具有多分化潜能。1984年Owen[7]首先将来源于骨髓，能自我复制并分化为数种间充质组织的细胞命名为骨髓间充质干细胞。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员之一，属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富。正是由于其具有多向分化潜能，扩增迅速，低免疫原性，取材方便，遗传背景稳定，并易于外源基因的转染和表达等特点，骨髓间充质干细胞日益受到人们的关注，并逐渐在基因治疗、组织修复等方面发挥了其广泛的应用前景[8,9]。现已有实验证实，骨髓间充质干细胞能促进肝细胞增殖，并抑制其凋亡[10]。目前，对骨髓间充质干细胞进行适当的基因修饰，使之高表达靶基因，是基因治疗的一种策略。众所周知，肝脏是机体具有强大再生能力的脏器。因而，在急性肝衰竭治疗中，如果能利用MSCs的特点和特异性的肝再生调控因子联合作用，在基因水平上调控和促进肝细胞分裂、修复，将有望最大程度的改善急性肝衰竭患者的预后。

(一)肝再生增强因子

肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration，ALR)是1994年Hagiya从乳鼠肝脏中分离出一种能促进肝脏再生的物质，并成功克隆了它的cDNA[11]。不同种属的ALR均由125个氨基酸残基所组成，其开放读码框(ORF)由375个核苷酸组成。哺乳动物ALR与酿酒酵母菌(S.cerevisiae)表达的蛋白有约40%的同源性[12]，因而也被称为S.cerevisiae的生长因子(essential for respiration and viability， ERV1)同源物。ALR又被称为肝细胞刺激物(HSS)或者肝细胞生成素(HPO)，是一种特殊的促肝细胞分裂原。与一些同样具有肝再生相关因子如肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)、转化生长因子-α(Transforming growth factor, TGF-α)、表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)不完全相同[13]，它调节线粒体的生成、细胞分裂周期，并与肝脏、睾丸等重要脏器发育有关，最主要的是能特异的刺激肝源细胞的增殖，在肝损伤修复过程中发挥重要作用。在某种病理条件下，血清ALR水平的改变甚至可以作为肝损伤/疾病的诊断标记物。实验证明，在CCl4诱导的ACLF大鼠中，ALR血清水平明显升高，ACLF初期高水平ALR与较好的预后有关[14]。许多研究认为，ALR以自分泌或旁分泌方式通过刺激EGF及ERK1/2和 Akt/PKB受体酪氨酸磷酸化，继而活化分裂原活化激酶而激活人肝细胞增殖[15]。ALR也可能通过影响NF-κB、细胞色素P-450、c-Myc 和多胺等合成而影响肝细胞增殖[16]。因此，基于其特殊的基因结构特点和多种生物学活性，使得该因子倍受国内外学者的亲睐。ALR完全有可能成为治疗急性肝衰竭的重要手段之一。新近的研究也证实，ALR可能通过抑制炎症反应和免疫排斥而发挥与自体细胞肝移植的协同作用，提高急性肝衰竭小鼠的生存率[17]。

(二)血管内皮生长因子

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF，也称为VEGF-A)是1989年Gospodarowicz等[18]从牛的垂体滤泡细胞中分离出一种能选择性促进血管内皮细胞分裂的蛋白质。随后，研究人员相继发现了VEGF的其他家族成员：VEGF-B、C、D和胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)。人的VEGF基因最先从人白血病HL-60细胞系中克隆出来，定位于6p21.3，有8个内含子和7个外显子，其mRNA通过不同的剪切方式编码5中不同的VEGF，分别由121、145、165、189和206个氨基酸组成，其中VEGF121和VEGF165为分泌型细胞因子，具有促进新生血管形成的活性。VEGF189、VEGF206及少量VEGF165与硫酸乙酰肝素具有亲和力而存在于细胞内。VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白，二条分子量各为24kDa的单链以二硫键组成二聚体。随着人们对VEGF深入了解，发现在成人和动物的正常组织中VEGF合成很少，但在胎儿、胎盘、黄体及大部分人类肿瘤等存在血管新生的组织中高表达。众所周知，血管形成是所有器官再生、创伤愈合、功能恢复的基本条件。急性肝衰竭时，肝细胞大块坏死，肝血窦塌陷。肝功能的恢复不仅需要肝细胞的再生，且依赖肝血窦等结构的重建。肝细胞再生、肝血窦重建，是决定急性肝衰竭患者预后的关键因素之一。实质上，残余肝细胞再生不充分是ALF患者死亡的主要原因。因此，肝细胞再生和血管形成关系密切。在所有的调节血管生长的因子中, VEGF是血管生成过程中最重要的因子[19]。在肝衰竭患者的肝细胞再生和修复中，是否有VEGF的参与，逐渐受到了科研人员的关注。Dfixler等[20]认为肝细胞再生是肝内血管形成的伴随现象。Maximilian等研究发现VEGF可以明显增加微血管密度及直径，可能通过刺激肝细胞HGF、IL-6、Ki-67的表达，促进肝细胞再生，恢复肝功能[21-23]。国内有学者对ALF大鼠肝残存组织检测发现VEGF高表达，也侧面验证了VEGF作为肝细胞再生不可或缺的因子发挥了重要作用。目前，国内外对VEGF参与ALF的肝细胞修复和再生的机制研究甚少。而以VEGF作为靶基因通过MSCs进行ALF的干预治疗尚未开展。基因治疗以其良好的靶向性广泛应用于临床，而MSCs不仅易于外源性基因的导入，而且转染率高并能稳定高效表达外源基因，是基因治疗的良好细胞载体。两者的结合可优势互补，既可以利用基因载体扩大干细胞的用途以治疗更多的疾病，又可以避免单纯基因治疗的缺陷，具有安全 、稳定而高效地表达 、不引起免疫反应 、可调节等优点。最近研究表明，MSCs不仅能够分泌VEGF，且经VEGF基因修饰的MSCs具有心肌保护作用[33]。因此，MSCs成为细胞移植和基因治疗中理想的载体细胞。

三、总结

近年来干细胞移植及基因治疗研究取得很大进展，将二者综合利用有望成为治疗ALF的另一种有效手段。由于肝脏的再生潜力很大，移植干细胞所提供的暂时、有效的肝功能支持，为受体肝脏的再生恢复赢得了时间，从而可使ALF患者有时间等待肝移植，甚至避免肝移植。而进一步研究ALF干细胞移植后的肝再生及机制，探讨其影响因素，对干细胞移植的临床应用亦具有重要的意义。

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(本文编辑：张苗)

2016-01-05)

黑龙江省自然科学基金项目(D201106)面上项目

150086哈尔滨医科大学附属第二医院传染科

杨宝山，Email：baoshanyang@126.com