彭文锋 综述 陈玲 审校

(遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563003)

支气管肺泡灌洗液检测在肺结核研究及临床应用中的进展

彭文锋 综述 陈玲△审校

(遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563003)

支气管肺泡灌洗； 肺结核； 检测

支气管肺泡灌洗术(BAL)是运用支气管镜对支气管以下肺段或亚肺段水平，反复以无菌生理盐水灌洗、回收，获得支气管肺泡灌洗液(BALF)，从病原微生物学、分子生物学、免疫学、细胞学及酶学等角度检测分析BALF性质，用于肺部疾病的诊断与鉴别诊断。在涂阴、无痰，标本获取困难而又急需抗结核治疗的肺结核患者，运用各种技术检测BALF中结核分枝杆菌或相关成份有利于疾病的诊断与鉴别诊断，为早期抗结核治疗提供病原学依据。本文就BALF在肺结核(PTB) 基础研究与临床应用的研究进展综述如下。

1 BALF传统方法检测结核分枝杆菌

传统肺结核的诊断主要根据症状、体征、痰抗酸杆菌涂片镜检，结核分枝杆菌培养及胸部X线/CT影像学。对痰菌阴性及无法获得痰标本的可疑肺结核患者，病原学确诊受到限制，因此，应用支气管镜进行BALF涂片、培养，结合刷检涂片、培养，及镜检后痰涂片、培养可提高结核分枝杆菌检出率。

在人免疫缺陷病毒(HIV)流行地区，BAL检查在合并HIV感染的菌阴肺结核患者也有很好的敏感性，二次BALF结核分枝杆菌检测阳性率高于一次[1]。支气管镜技术也有助于儿童肺结核的诊断与病情评估，E.Cakir[2]对167名2个月至16 岁临床诊断肺结核儿童行纤维支气管镜检查，以评估气道受累风险及获取标本进行涂片、培养，结果显示BALF检测阳性率(48/167，28.7%)略低于胃液 (GA) (54/167，32.6%)，联合BALF涂片及培养能使阳性率提高至41.9%。虽然有学者[3]认为疑似肺结核儿童支气镜检标本结核菌阳性率不高，但随着支气镜检查设备的更新发展，其在复杂性肺结核的诊断方面支气管镜具有非常重要的价值。BAL在肺结核的诊断有很好的运用价值，但存在发生结核分枝杆菌交叉感染的风险，同时需更高成本。有鉴于此，可运用更为简单与安全的痰诱导法(SI)诊断菌阴或无痰的肺结核患者，3次SI所获标本结核分枝杆菌阳性率与BALF类似，此操作需在呼吸道隔离检查室进行以防止院内传播。如SI标本量不够，BAF仍可选择。

2 BALF分子生物学方法检测结核分枝杆菌

聚合酶链反应 (PCR)，是对特定DNA片段在体外进行快速扩增的方法，数小时内即可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107～108倍，用于BALF结核分枝杆菌DNA检测具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等优点。张宏英等[4]运用集PCR和DNA探针杂交技术为一体的荧光定量PCR技术分别检测痰和BALF结核分枝杆菌，BALF具更高敏感性，而特异性相近。对于合并HIV感染的患者，运用高敏感性的荧光定量PCR检测BALF中结核分枝杆菌，Kibiki界定CT值为32时，敏感性达到85.7%，特异性90.9%，但对PCR阳性， BALF培养阴性的患者随访18个月未发现进展为活动性肺结核，说明PCR阳性结果对病情判断存在一定局限性。上述各项研究结果之间敏感性、特异性的差异可能与研究对象的选择、PCR实验设计，数据处理方法不同有关，但都认为在菌阴或无痰的肺结核患者，PCR检测BALF中结核分枝杆菌DNA高效可靠。同时，PCR的高灵敏也容易出现假阳性，应重视标本前期采集与处理，避免污染。2010年12月WHO批准基于PCR原理的Xpert®MTB/RIF技术用于结核分枝杆菌的快速检测，统一的操作程序与检测设备减少了各实验室之间的误差。H.Y.Lee[5]以最终培养结果为参照，Xpert®MTB/RIF用于支气管冲洗液及BALF结核分枝杆菌早期检测有非常高的准确性，敏感性与特异性显著高于痰涂片。P.Le Palud[6]研究指出Xpert®MTB/RIF阳性率与BALF等气道标本培养结果相近，在结核病低负担国家用于肺结核的早期诊断是有益的。G.Theron[7]纳入160例无痰或涂阴疑似肺结核患者，BALF标本用于Xpert®MTB/RIF检测及培养，Xpert®MTB/RIF检测结果可靠，重复性好，不受BALF离心沉淀、合并HIV感染影响，是否耐利福平也避免了经验性治疗，有利于制定合理的抗结核治疗处方方案。Xpert®MTB/RIF检测儿童BALF也有很高的敏感性与特异性[8]，<3岁未接种过BCG且与肺结核患者有接触史儿童，BALF Xpert®MTB/RIF阳性率明显升高，应引起重视[9]。

3 BALF中结核抗原、抗体、免疫细胞和细胞因子的检测与分析

结核病涉及全身各个器官组织，如肺结核、结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、骨结核、淋巴结结核等，主要引起局部病变。目前，大多数结核病免疫学诊断方法主要检测与分析人外周血结核抗原、抗体、细胞成份及细胞因子，特异性差、敏感性低、干扰因素较多，而对局部病灶上述成份的研究相对较少。应用免疫学方法检测BALF中抗原、抗体等可能有助于发现更具敏感性与特异性的生物标志物用于诊断菌阴肺结核、评估疾病的严重程度、预后等。酶联免疫吸附测定(ELISA) 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定，是常用的一种实验室检测技术，目前多用此法检测BALF中结核分枝杆菌各种相关的抗原抗体和细胞因子。魏娟[10]对包括BALF在内的非血体液标本IGRA检测价值进行了总结，C.Jafari[11]认为BALMC ELISpot对涂阴活动性肺结核的诊断优于PBMC ELISpot，前者不受既往感染结核分枝杆菌的影响，H.Li[12]也得出相似结论。而在合并HIV/AIDS进展期的涂阴肺结核患者，BALMC ELISpot特异性较差(48%, 95% CI 32%～64%)，IGRA结果不确定性高于PBMC ELISpot (34% VS. 14%, difference 20%, 95% CI 7%～33%, p 0.002)，A.Cattamanchi[13]不建议在HIV/AIDS流行的结核病高负担地区运用BALMC ELISpot诊断涂阴肺结核，BALMC ELISpot结果在此类患者的不确定性及低特异性原因尚需进一步研究。针对BALF中各种免疫细胞研究主要集中于T淋巴细胞数量、亚型，也有B淋巴细胞、巨噬细胞相关研究。BALF中Th1淋巴细胞激活和肺泡巨噬细胞分泌IFN-γ共同引起结核病变部位的细胞免疫反应，R.F.Silver用支气管镜给受试者灌注0.5个单位PPD，48 h后获取BALF，PPD阳性者BALF中CD4+T细胞和分泌IFN-γ的炎症细胞数比例增加，而PPD阴性者未见炎症反应，这种激发模型有助于明确局部抗结核的免疫炎症反应机制。非HIV感染的慢性复发性肺结核患者BALF中CD8+T细胞增加，CD4/CD8比值下降，认为T淋巴细胞亚群比例失衡在机体防御结核分枝杆菌感染方面起主要作用。ALF中各免疫细胞最终是通过分泌各种炎症细胞因子起作用的，肺泡巨噬细胞的激活并分泌IL-1β，IL-6和TNF-α参与了结核结节形成与局部感染的控制，E.Küpeli[14]认为BALF中TNF-α水平在鉴别健康者与涂阴肺结核是一项非常有用的指标，活动性肺结核BALF淋巴细胞、中性粒细胞升高同时伴IL-8, MCP-1明显升高，恢复期肺结核MCP-1较健康对照组下降、未检测到IL-8，据此K.Kurashima[15]指出宿主在对抗结核感染不同阶段有不同细胞因子参与，而唐神结等[16]认为TNF-α、sTNF-R I、IL-1β和IL-1受体水平的检测可作为了解疾病活动性、判断病情及预后、监测抗结核疗效的参考。在非空洞型AIDS肺结核患者IP-10和 IL-7水平高于空洞型，这些因子在空洞型患者BALF的下调可能导致了AIDS患者结核病情的进展，而IL-4 和 IL-12p40上调促进了病情的恶化[17]。新近又发现由肺结核诱发的ARDS患者BALF中CXCL8(IL-8)水平显著升高，开发CXCL8抑制剂或阻断剂可能有助于这类患者的临床治疗[18]。

儿童肺结核患者BALF中细胞因子的研究较少，E.M.Auber-Pivert[19]通过测定BALF各类细胞分泌的6种炎症因子(IFN-γ、IL-12, TNF-α, IL-10, IL-4, TGF-β1)mRNAs表达水平以评估病情进展和病理机制，指出儿童肺结核发病可能与Th1型免疫应答反应减弱相关。E.Cakir[20]等最近一项研究则认为肺结核儿童BALF中人抗菌肽(LL-37/hCAP-18)和人β防御素(hBD)可能在抵抗结核分枝杆菌感染的固有免疫反应中发挥重要作用

4 BALF中酶的检测与分析

腺苷脱氨酶ADA已常规作为一项诊断结核性胸膜炎的参考指标，而BALF中ADA测定与分析研究不多。M.Kubota[21]纳入64例研究对像，6例粟粒性肺结核、21例结节病、15例特发性肺纤维化、15例其它肺部疾病和7例健康对照。粟粒性肺结核组BALF中ADA平均值为5.02+/-3.75 IU/L，明显高于其它各组，ADA 2.0 IU/L作为临界值用于早期诊断粟粒性肺结核具很好的敏感性，检测BALF-ADA有助于涂阴肺结核的诊断及与其它肺部疾病鉴别。而O.Kayacan[22]则指出单独测定BALF-ADA在肺结核与其它肺部疾病鉴别诊断方面参考价值有限，需结合其它指标。活动性肺结核患者BALF中其它酶的检测也有相关研究，但特异性与敏感性尚需进一步研究。

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