马珍元，黄呈辉，张新枝，钟世良，田建华（南方医科大学附属深圳宝安医院，广东深圳518101）



2014年深圳市流行的1型登革病毒分子溯源分析*

马珍元，黄呈辉，张新枝，钟世良，田建华
（南方医科大学附属深圳宝安医院，广东深圳518101）

摘要：目的对2014年深圳市登革热（DF）流行时分离的登革热1型病毒株（DENV-1）进行E基因序列测定，了解其分子病毒学特征，探讨其可能来源。方法收集35份2014年深圳市DF患者急性期血清标本，用乳仓鼠肾细胞（BHK-21）分离DF病毒，并用逆转录-半套式聚合酶链反应（RT-PCR）反应对其进行型别鉴定。RT-PCR扩增全长E基因，测序并进行同源性与进化树分析。结果35份血清样本中分离到DENV-1 21株。选取6株深圳DENV-1分离株测序，E基因全长1 485 bp，编码495个氨基酸。6株深圳市DENV-1分离株同源性为100.0%，其同源性与深圳市2010流行株接近，核苷酸和氨基酸同源性分别为99.5%和99.8%，与新加坡2009和日本2004流行株的核苷酸和氨基酸同源性最高达99.7%和100.0%。进化分析发现，深圳6株DENV-1属于基因型1型，与Shenzhen2010、Singpore2009、Japan2004的亲缘关系较近，在同一进化支上。结论2014年深圳市DENV-1属GⅠ亚型，最可能来源于东南亚一带，于2010年本地化而引起2014年DF流行。

关键词：登革热；登革热病毒；E基因；序列测定；系统进化树

登革热（dengue fever，DF）是由登革病毒（dengue virus，DENV）引起的一种严重的急性虫媒传染病。近十年来，登革热在全世界的发病率提高近30倍，波及全球100多个国家和地区，成为世界性的公共卫生问题[1]。在我国，登革热主要流行于广东、海南、广西、福建、台湾等南方及东南沿海省份。深圳自成立经济特区以来，2001年报告首例输入性登革热病例，之后不断有散在输入性病例报告，主要来源于周边城市及东南亚国家。2010年10月深圳市福田某工地上发生首起本地登革热暴发流行，流行规模以局部低强度流行为主[2]。2014年9月-2014年12月深圳再次发生本地登革热暴发流行，全市共报道确诊病例454例，流行规模较2010年明显扩大。为分析2014年DENV流行株的可能来源，本研究对2014年深圳市登革热暴发流行期间分离的部分登革热1型病毒株进行E基因序列测定和分子进化分析，现报道如下。

1　材料与方法

1.1标本来源

选取2014年登革热暴发流行期间在本院感染科住院的35例患者。参照卫计委2014年制定的登革热诊疗指南（第二版）[3]，所有入选患者为登革热确诊病例，其中男性20例，女性15例，年龄15～83岁，平均年龄41.3岁。收集患者急性期血清，4℃、3 000 r/min（离心半径5 cm），低速离心5 min分离血清，置于-70℃冰箱冷冻保存。

1.2病毒培养分离及RNA提取

采用乳仓鼠肾细胞-21（baby hamster syrian kidey，BHK-21）分离患者血清样本中登革病毒。BHK-21细胞由南方医科大学公共卫生与热带医学院微生物实验室惠赠。35份血清样本用维持液1∶10稀释后，接种至培养良好的单层BHK-21细胞，37℃吸附1 h后弃上清液，加入适量维持液，置37℃、5%二氧化碳CO2细胞培养箱中培养，每天在显微镜下观察细胞病变情况并拍照，6 d后传代。以出现细胞病变为阳性，盲传3代无细胞病变则为阴性。待＞75%细胞出现病变时收取病毒。采用大连宝生生物工程有限公司的病毒RNA提取试剂盒提取分离株RNA。取阳性培养液上清200μl，加入200μl裂解缓冲液、20μl蛋白酶K和1.00μl Carrier RNA，56℃水浴10 min。加入200μl无水乙醇，充分混匀后移至核酸纯化柱中，离心后弃滤液，洗脱缓冲液洗脱病毒RNA，溶于50μl去离子水，于-20℃保存备用。

1.3病毒核酸检测和型别鉴定

参照Lanciotti等[4]所报道的方法，采用逆转录-半套式聚合酶链（reverse transcziption-polymerase chain reaction，RT-PCR）反应进行登革病毒核酸检测及亚型鉴定，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4RT-PCR扩增E基因

参考已报道的DENV-1（GenBank登录号：AF309641）基因组序列，用Primer 3.0分别设计合成2对DENV-1的E基因扩增测序引物，引物序列为：DENV-1-E-正向引物1：5´-GCGTTCCATTTGA CTACACGATGG-3´，DENV-1-E-反向引物1：5´-AT GGTGTTGTTGACAATGAAAGC-3´，目标产物长度为1 108 bp；DENV-1-E-正向引物2：5´-CAGTAAT AGTCACCGTCCACA-3´，DENV-1-E-反向引物2：5´-GTTGTAGGAGATGTTGCTGGGAT-3´，目标产物大小为1 234 bp，片段可完全覆盖E基因区域。采用大连宝生生物工程有限公司二步法RT-PCR试剂盒进行检测。第一步将病毒RNA逆转录为cDNA：取3μl病毒RNA作为模板，加入随机的6核苷酸引物、4种脱氧核苷三磷酸混合液，无RNA酶水补足到10μl，65℃保温5 min后4℃冷却进行变性、退火反应，在上述反应液中依次加入RNA酶抑制剂、逆转录酶、5×缓冲液，无RNA酶水补足到20μl，于30℃、10 min，42℃、30 min逆转录反应，95℃、5 min 后4℃冷却，灭活逆转录酶。第二步进行PCR反应，反应液组成：10×PCR缓冲液5μl、4种脱氧核苷三磷酸混合物（各10 mmol）2μl、Taq DNA聚合酶（5 u/μl）0.5μl、正向引物和反向引物（10μmol）各0.5μl、逆转录液5μl，无RNA酶水补足到50μl。反应条件为：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35个循环，72℃继续延伸10 min。用Tris-硼酸缓冲液配制含0.5μg/ml溴化乙锭的1.5%的琼脂糖凝胶，取5μl PCR产物，与1μl上样缓冲液混和，在Tris-硼酸缓冲液中以80 V恒压电泳1 h，在透射式紫外分析仪上观察，并拍照记录实验结果。如果条带的分子质量与预期片段大小相同，则判断为阳性结果。

1.5序列测定和拼接

PCR产物由上海生工生物工程有限公司纯化后进行正、反向测序。测序完成后，将测序结果分别用美国生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）网站提供的在线软件进行序列分析，确认无误后，各片段序列采用DNA Star软件中的SeqMan拼接成完整的E基因序列。

1.6基因序列的同源性和进化分析

利用NCBI BLASTn对GenBank基因数据库进行同源性检索，并利用Clustalx（1.83）软件进行同源性比较。用MEGA 4.1的邻接法（Neighbor-Joining）完成系统发生树的构建。模型采用Kimura 2-Parameter model，Bootstrap值设定为1 000。

2　结果

2.1DENV分离培养结果

用BHK-21细胞对35份血清样本进行病毒分离培养，其中21份标本出现细胞肿胀变圆、空泡结构（见图1）。病毒分离阳性率为60.0%。

2.2RT-PCR反应鉴定DENV型别

对21份阳性培养液上清提取病毒RNA后，用RT-PCR反应检测登革病毒核酸并鉴定型别，通用引物进行第一轮扩增后，21株分离株可扩增出511 bp片段，与实验设计的大小吻合。将第一轮扩增产物作为模板进行第二轮扩增，获得482 bp DENV-1型特异性条带，阴性对照未见任何条带。见图2。

图1　BHK-21细胞分离培养DENV结果（×200）

图2　DENV-1 RT-PCR反应分型检测及E基因扩增电泳结果

图3　2014年深圳市6株DENV-1型E基因推导的氨基酸同源性分析

2.3DENV-1型E基因的RT-PCR扩增及序列测定

选取症状典型、发病时间早、发病地点不同的6株分离株进行E基因扩增，所有标本在1000～2000bp出现明显目的条带（见图2）。经测序及拼接后显示，所有分离株E基因全长1 485 bp，推导编码495个氨基酸，未发现序列插入或缺失，核苷酸差异广泛分布于整个序列。

2.4DENV-1型E基因同源性分析

6株深圳DENV-1分离株E基因核苷酸同源性为100.0%，推导的495个氨基酸序列亦完全一致（见图3）。将2014年深圳市DENV-1分离株与国内30年来部分年份DENV-1流行株进行E基因同源性比较（见附表），结果显示，深圳市DENV-1分离株与国内2010、2007和2004年份分离到的Shenzhen2010（JN029813）、Zhuhai2007（EU359008）、Fujian2004（DQ193572）流行株同源性较高，核苷酸同源性在98.9%～99.5%，氨基酸同源性为99.4%～100.0%，尤其与Shenzhen2010（JN029813）的同源性最高，核苷酸及氨基酸同源性分别为99.5%和99.8%；与其他国家分离到的DENV-1毒株，如Singpore2014（KJ806961）、Singpore2009（JF960216）、Singpore2004（EU069606）、Japan2004（AB178040）有很高的相似性，与这些毒株在该区域的核苷酸同源性最高达99.7%，氨基酸同源性最高达100.0%。6株深圳市DENV-1分离株与上述DENV-1型毒株E蛋白区氨基酸序列相似，均各有2个糖基化位点，分别位于E蛋白区的第67～70和153～156位，E蛋白相关毒力位点E（44）、E（156）、E（366）处均无变异。

2.5E基因进化分析

图4　2014年深圳市DENV-1分离株E基因系统进化树分析

附表　2014年深圳市DENV-1分离株核苷酸及推导氨基酸序列同源性比较　%

为进一步分析深圳D1分离株的进化关系，笔者将6株深圳DENV-1分离株的E基因序列与基因库中下载的世界其他流行区分离株的序列相比对，并绘制基因系统进化树（见图4）。40株登革1型毒株被分成4个基因亚型，分别对应Goncalvez等[10]的Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ基因型。6株深圳市DNEV-1分离株位于基因型Ⅰ型进化支上，与Shenzhen2010 （JN029813）、Fujian2004（DQ193572）、Singpore2009 （JF960216）、Japan2004（AB178040）亲缘关系较近，位于同一分支内。

3　讨论

登革病毒根据抗原性不同分为4个血清型，分别为DENV-1、DENV-2、DENV-3及DENV-4，依据病毒E基因不同又可以分成不同基因亚型（genotype）GⅠ～GⅤ，不同的地理区域流行着不同的血清型和基因亚型[5，12]。广东省以DENV-1为主要流行的血清型，其中优势基因亚型为GⅠ亚群，少数为GⅣ亚群[6-7]。通过测定病毒核酸或蛋白序列，比较分析序列间的同源性和进化关系，从分子水平追踪传染源，对病原进行溯源，是目前病毒分子流行病学调查的主要手段之一。由于登革病毒包膜蛋白由E基因所编码，位于病毒颗粒表面，构成颗粒的突起，是主要的结构蛋白。其决定病毒的组织亲嗜性，并介导病毒与细胞受体的结合[8]，同时还是影响毒力，诱导特异性的保护性中和抗体及免疫病理损伤的重要成分[9]。因此，E基因是分析登革病毒基因亚型、病毒变异与进化的最适片段。

本研究中6株DENV-1分离株E基因全长为1 485bp，编码495个氨基酸，未见序列插入或缺失。6株病毒分离株E基因同源性达100.0%，表明虽然深圳DENV-1分离株的样本来源不同，即患者不同、发病时间不同、发病地点不同，但是分离株为同一性状的登革1型病毒，即6例患者为同一毒株感染引起的子代患者。结合患者流行病学资料分析，6例患者为深圳市居民。所有患者在发病前1个月在深圳市居住，无输血史、无外出史，缺乏输入性感染的依据。因此可以判断6株深圳市DENV-1分离株为2014年深圳市本地流行株。

E基因同源性分析显示，2014年深圳市DENV-1分离株与国内2010、2007和2004年份分离到的流行株同源性较高；与其他国家流行的DENV-1分离株在该区域的同源性比较，相似性较高的主要是新加坡和日本等地流行株。2002年，Goncalvez等[10]利用DENV-1全长E蛋白编码基因进行系统发育分析，将世界各地分离的44株DENV-1分离株分为5个基因型：Ⅰ型，以HAWAII/1945分离株为代表；Ⅱ型，以泰国20世纪50、60年代分离株为代表；Ⅲ型，只有Sylvatic株；Ⅳ型，包括West Pacific株、Austria分离株；V型，主要包括美洲一些分离株。将本次疫情中分离到的6株深圳DENV-1分离株与其他DENV-1型病毒分离株进行比较，根据E蛋白编码基因构建系统进化树，6株深圳DNEV-1分离株位于GⅠ亚群进化支上，与Shenzhen2010（JN029813）、Fujian2004（DQ193572）、Singpore2009（JF960216）、Japan2004（AB178040）亲缘关系较近。

为进一步揭示深圳市登革热流行病学概况，本实验将2014年6株深圳DENV-1分离株与2010年深圳DENV-1分离株比较发现，两者高度同源且进化距离相当接近，传播链时隔4年，提示本次流行的DENV-1与2010年流行株关系密切，因此笔者推测2010年流行株本地化并引起2014年登革热流行的可能性。无论从E基因的核苷酸序列还是氨基酸序列来看，2010和2014年深圳市分离株都是与新加坡2008、2009、2010、2013和2014年份分离到的Singpore2008（GQ357687）、Singpore2009（JF960216）、Singpore2010（JF960223）、Singpore2013（KJ806949）、Singpore2014（KJ806961）流行株最为接近，而该5株新加坡分离株之间核苷酸同源性为99.1%～99.8%，氨基酸同源性为99.6%～100.0%，可以认为是同一来源的分离株。进一步分析发现，Singpore2008 （GQ357687）、Singpore2009（JF960216）、Singpore2010 （JF960223）、Singpore2013（KJ806949）、Singpore2014 （KJ806961）与Singpore2004（EU069606）有极高的相似性，核苷酸及氨基酸序列的同源性＞99.5%；而Singpore2004（EU069606）与Japan2004（AB178040）高度相关，两者同源性达99.9%。因此笔者推断，2010和2014年深圳DENV-1流行株是输入性的，极有可能是Japan2004（AB178040）（由密克罗尼西亚传人日本），于2004年由日本传入中国的福建、广东及新加坡，之后该毒株一直在新加坡和中国循环，并传入深圳市，在深圳市发生独立进化，于2010和2014年引起深圳市本地暴发流行。

理论上，一个地区连续发生输入性病例与本地暴发流行，加上人口增长及流动性增加等因素，可能使其从无DF流行地区（无病毒存在）变为低地方性流行区（一种血清型别流行）和高地方性流行区（多种病毒血清型别流行）[11-12]。深圳市作为中国的窗口城市，处于登革热流行地区的包围中，国内外交往和人口流动频繁，输入性病例不断增加；地处亚热带，气候温暖潮湿，雨量充沛，利于蚊媒孳生，并且探明存在传播媒介白纹伊蚊[13]。此外，对深圳市16～60岁健康人群登革热抗体水平调查中，检测到登革病毒IgG抗体阳性率为4.3%，从而证实登革热隐形感染的存在[14]。特别是2010年深圳市福田报道首起本地登革热暴发流行，客观上说明深圳市地区已存在登革热流行条件。而2014年深圳市登革热再次出现本地流行，更应该引起疾病预防控制机构的警惕，尽早做好各项防控措施，阻止深圳市转变为登革热的中等地方性流行区，甚至高等地方性流行区。

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（童颖丹编辑）

临床论著

Molecular phylogenetic analysis of type 1 strains of dengue virus isolated in Shenzhen City during the 2014 dengue outbreak*

Zhen-yuan Ma, Cheng-hui Huang, Xin-zhi Zhang, Shi-liang Zhong, Jian-hua Tian
(The Affiliated Shenzhen Baoan Hospital, Southern Medical University, Shenzhen, Guangdong 518101, China)

Abstract:Objective To determine the envelope (E) gene sequence of type 1 dengue virus (DENV-1) isolated in Shenzhen in 2014, and to understand the molecular virology characteristics of these strains as well as to explore their possible origin. Methods Thirty-five serum samples were collected from patients with dengue fever. Dengue virus was isolated by BHK-21 cells and the serotypes were detected by semi-nested polymerase chain reaction (PCR). The E gene of the isolated strains was amplified by RT-PCR and sequenced. Homological and phylogenetic trees were also constructed based on the E gene of isolated dengue virus strains. Results Totally 21 strains were isolated from 35 samples and identified as type 1 dengue virus. The complete coding region of E genes from 6 strains of DENV-1 was all composed of 1,485 nucleotides which encoded 495 amino acids. Nucleotide sequence homology of 6 strains of DENV-1 was 100.0%identical, and their homology was very similar to the epidemic strains of DENV-1 virus in Shenzhen in 2010. The homology of the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence was 99.5% and 99.8%respectively. Compared with epidemic DENV -1 strains isolated from other countries, DENV-1 from Shenzhen in 2014 was close to the strains isolated in Singpore and Japan, and the highest homology of their E genes and the deduced amino acids was 99.7% and 100.0%. The phylogenetic tree of E genes indicated that the 6 strains of DENV-1 had the greater similarity with Shenzhen2010, Singpore2009 and Japan2004; and they all belonged to the genotype GⅠ. Conclusions DENV-1 strains from Shenzhen in 2014 belonged to thebook=40,ebook=46genotype GⅠ. They most likely originated from Southeast Asian countries. These epidemic dengue virus strains had been settled down in Shenzhen in 2010 and caused 2014 dengue fever outbreak.

Keywords:dengue fever; dengue virus; Egene; sequencing; phylogenetic tree

[通信作者]黄呈辉，E-mail：hchuisz@126.com

*基金项目：深圳市宝安区科技计划项目（No：2015253）

收稿日期：2015-08-14

文章编号：1005-8982（2016）03-0039-06

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.008

中图分类号：R512.8

文献标识码：A