王　瑢，　顾思成，　郭剑芬，　黄世光

(暨南大学医学院口腔医学系，广东 广州 510632)



▲ 并列第1作者

高压氧疗法对大鼠心理应激相关牙周炎治疗作用及低氧诱导因子1α表达的研究*

王瑢▲，顾思成▲，郭剑芬，黄世光△

(暨南大学医学院口腔医学系，广东 广州 510632)

[摘要]目的： 探讨高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)治疗对心理应激相关牙周炎牙周组织低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)表达的影响。方法: 清洁级4周龄雄性Wistar大鼠120只，随机分为4组：正常对照组；单纯应激组；牙周炎组：用浸有牙龈卟啉单胞菌株的丝线结扎左侧上颌第二磨牙牙颈部，复制实验性牙周炎模型；牙周炎+应激组。于实验后第9周停止应激刺激，对除正常对照组外其它各组大鼠每组选取6只进行HBO治疗。于实验后2、4和8周末分批处死未治疗动物，每组处死6只;于实验后10周末处死HBO治疗及未治疗动物。处死前测量术区的牙周附着情况，制作牙体牙周联合切片，观察牙周的组织学改变。免疫组化法检测各组大鼠牙周组织HIF-1α的表达水平，计算平均阳性细胞率。结果: 大体观察见正常对照组及单纯应激组牙周附着位置正常；牙周炎组出现牙龈萎缩，附着丧失明显；牙周炎+应激组附着丧失明显，根分叉暴露，HBO治疗后，牙龈水肿减轻，牙周袋变浅；组织学观察见牙周炎+应激组牙周组织破坏程度在各时点均重于牙周炎组；经HBO治疗后，牙周组织炎症程度减轻，炎症细胞浸润减少；牙龈指数(gingival index, GI)及牙周附着丧失(attachment loss, AL)检查见单纯应激组与正常对照组在各时点均无显著差异；在第4、8周时牙周炎+应激组GI、AL明显高于牙周炎组(P<0.01)；HBO治疗结束后牙周炎组及牙周炎+应激组GI、AL明显低于未治疗组(P<0.05)；单纯应激组与正常对照组HIF-1α免疫组化平均阳性细胞率在各时点均无显著差异；牙周炎+应激组HIF-1α平均阳性细胞率在第4、8周时均明显高于牙周炎组(P<0.01)；HBO治疗结束后牙周炎组及牙周炎+应激组HIF-1α平均阳性细胞率较未治疗组降低(P<0.01)。结论: 心理应激可加重牙周组织缺氧程度从而加重牙周炎症状，HBO通过增加牙周组织的氧供应量对大鼠实验性牙周炎及心理应激相关牙周炎有显著的治疗效果。

[关键词]牙周炎； 心理应激； 高压氧； 低氧诱导因子-1α

牙周炎是侵犯牙龈和牙周组织的一种慢性炎症性疾病，主要特征为牙周袋的形成、袋壁的炎症和牙槽骨吸收，是导致成年人牙齿丧失的主要原因[1]。研究表明，微生物是牙周病的启动因子，心理应激与炎症性疾病如类风湿性关节炎和牙周病之间有关联[2]，是牙周病潜在的重要的风险因子[3]。氧代谢对牙周组织生理机能的维持起着重要的作用，应激在影响牙周组织氧代谢方面的机制，目前尚不清楚，国内外的研究也极少涉及。高压氧(hyperbaric oxygen, HBO)疗法是缓解组织缺氧，增加组织氧分压的一种有效手段。目前对HBO治疗心理应激相关牙周炎牙周组织氧代谢的研究尚未见报道，因此，本研究通过建立大鼠牙周炎模型，观察HBO疗法对心理应激相关牙周炎牙周组织低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)表达的影响，探讨高压氧治疗对心理应激相关牙周炎牙周组织氧代谢的作用。

材料和方法

1材料

SPF级Wistar大鼠购于中山大学医学实验动物中心；牙龈卟啉单胞菌株 (P.gingivalis)由本室保存；大鼠HIF-1α免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。YLC0 5/1型婴儿高压氧舱由西安第七零一研究所提供。

2方法

2.1牙周致病菌附着丝线制备将3/0无菌丝线置于含有P.gingivalis的改良GAM培养基(1 mg/L维生素K1、5 %脱纤维蛋白羊血)中，于37 ℃厌氧培养箱(体积分数为80 % N2，10 % H2，10 % CO2)中培养5 d。

2.2动物模型的建立选取120只SPF级8～9周龄雄性Wistar大鼠，购于中山大学医学实验动物中心，在恒温(22 ℃)、光照周期12 h∶12 h、无特殊致病菌的环境中饲养1周后进行实验。实验分组如下：将实验动物编号，按随机数字表法分成以下4组，每组30只大鼠：正常对照组：牙周不做任何处理；单纯应激组：牙周不做任何处理，于实验第0 d开始每日予以心理应激刺激；牙周炎组：采用戊巴比妥钠麻醉后用浸有P.gingivalis菌的3/0丝线结扎大鼠左侧上颌第二磨牙牙颈部，结扎丝线置于龈沟内，于近中颊处打结，建立牙周炎模型(图1)；牙周炎+应激组：按上法复制牙周炎模型，同时于术后第0 d起每日施以心理应激刺激。上述各组大鼠除了正常对照组外，牙周炎组、单纯应激组和牙周炎+应激组于实验第9周开始停止应激刺激，每组选取6只进行HBO治疗，连续治疗2周。于实验后2、4和8周末分批处死未治疗动物，每组处死6只；于实验后10周末处死HBO治疗动物及未治疗动物。

Figure 1.A standard ligature picture showed wrapped silk．

图1浸有牙周致病菌的3/0丝线结扎大鼠上颌第二磨牙牙颈部

2.3应激方案采取3种应激方案：(1) 限制性应激：将大鼠置于空间局限的小铁笼中，每天限制其活动及饮食5 h；(2) 浸泡冷水应激：将大鼠置于空间局限的小铁笼中，并用冷水浸至大鼠锁骨以上位置，每天浸泡2 h(图2)；(3) 猫惊吓应激：选择发情期雌猫，叫声刺耳，躁急，好动，将鼠笼置入猫笼中，每天12 h。实验开始后，每天随机选择上述3种应激方案中的一种施于应激组大鼠，以模拟现实社会应激源的多样性和不可预料性。

Figure 2.Ice water stress: put the rats in tiny cages with appropriate ice water for 2 h per day.

图2冰水混合物浸泡应激

2.4HBO治疗方案于实验第9 周停止应激刺激。上述各组大鼠除了正常对照组外，牙周炎组、单纯应激组和牙周炎+应激组每组随机选取6只大鼠进行HBO治疗(0.25 Mpa，YLC0 5/1型婴儿高压氧舱)，其余为未治疗组。HBO治疗每天1次，每次暴露60 min，连续治疗2周，于实验第10周末处死动物。

2.5牙龈指数(gingival index, GI)及牙周附着丧失(attachment loss, AL)的测量采用0.3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠，待其进入麻醉状态后，取仰卧位，固定头部及四肢，使用钝头牙周探针检查大鼠后牙牙周情况，参照Löe等[4]的4级法测量牙龈指数： 0表示牙龈健康；1表示牙龈轻度炎症(牙龈的颜色有轻度改变并轻度水肿，探诊不出血)；2表示牙龈中等炎症(牙龈色红，水肿光亮，探诊出血)；3表示牙龈严重炎症(牙龈明显红肿或有溃疡，并有自动出血倾向)。检查每颗实验牙的牙龈组织，测量近中颊乳头、正中颊缘、远中颊乳头和舌侧龈缘共4个点，记分为4个牙面记分的平均值。选用自制牙周探针探测牙周附着情况，牙周探针的刻度单位与工作端直径均为0.2 mm，测量釉牙骨质界至牙周袋底的距离为附着丧失。探诊部位为实验牙颊、腭侧近中、中央、远中6个点测量，取平均值。

2.6组织学观察取出上颌骨，由中线切开，10 %甲醛溶液(pH 7.0)固定48 h以上；采用混合脱钙液进行脱钙；制成近远中向5 μm厚度的牙体牙周组织联合切片，HE染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察牙周组织学改变。

2.7免疫组织化学SABC法检测HIF-1α的表达HIF-1αⅠ抗稀释浓度为1：50，DAB 显色液显色。阴性对照采用PBS缓冲液代替Ⅰ抗，苏木素轻度复染。免疫组化阳性信号为棕黄色细小颗粒，定位于细胞核或细胞浆。对每个标本切片中阳性细胞进行记数。每个切片记数5个视野下总细胞数及阳性细胞数，计算阳性细胞率(%)，即阳性细胞数占总细胞数的比例，取其平均值，为该标本切片的平均阳性细胞率。

3统计学处理

应用SPSS 13.0统计学软件进行分析处理，所有数据以均数±标准差(mean±SD)表示。多样本间的比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组方差齐时，多个样本均数间的两两比较采用SNK-q检验，若方差不齐时采用Tamhane’s T2法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1大体观察及组织学改变

1.1大体观察正常对照组及单纯应激组牙龈上皮结构完整，牙周附着位置正常，位于釉牙骨质界附近的牙齿表面。牙周炎组第2 周时可见轻度牙龈萎缩，探及浅牙周袋，尚无明显附着丧失；第4周时出现牙龈萎缩，附着丧失明显；第8周时附着丧失明显加重。牙周炎+应激组第2周时探及牙周袋，可见附着丧失；第4周时附着丧失严重；第8 周时附着丧失明显加重，根分叉暴露，累及两侧邻牙。于第9周开始停止应激刺激进行HBO治疗后，牙龈水肿减轻，探诊见牙周袋变浅，见图3～5。

1.2组织学改变正常对照组可见牙周组织未见明显炎症表现，附着位置未见异常。牙龈上皮结构完整，牙周膜纤维排列整齐，结缔组织内未见明显的炎性细胞浸润，固有牙槽骨形态结构完整。单纯应激组与正常对照组相比无明显区别，组织学观察见牙周组织结构正常，牙周膜纤维排列整齐，沟内上皮、结合上皮完整，未见牙槽骨吸收。牙周炎组的组织学观察见牙龈上皮溃疡，组织深部可见大量炎症细胞浸润，结合上皮向根方增殖，胶原纤维变性，血管扩张充血，牙槽骨表面破骨细胞活跃，见凹坑状骨吸收，牙槽嵴顶高度降低。牙周炎+应激组可见结合上皮向根方增殖、凹坑状骨吸收更为明显，牙槽嵴顶高度降低，大量炎症细胞浸润。HBO治疗后大鼠牙周组织炎症减轻，结缔组织内炎性细胞浸润减少，牙周组织中血管开放的数目增多，见图6。

Figure 3.The samples after ligature．A: normal control group(8 weeks); B: stress group (8 weeks); C: untreated stress group (10 weeks); D: treated stress group (10 weeks).Yellow arrows: teeth; red arrows: periodontium.

图3对照组及单纯应激组大体标本改变

Figure 4.The samples of periodontitis group．A: 2 weeks; B: 4 weeks; C: 8 weeks; D: untreated (10 weeks); E: treated(10 weeks). Yellow arrows: teeth; red arrows: periodontium.

图4牙周炎组大体标本改变

Figure 5.The samples of periodontitis+stress group．A: 2 weeks; B: 4 weeks; C: 8 weeks; D: untreated (10 weeks); E: treated(10 weeks). Yellow arrows: teeth; red arrows: periodontium.

图5牙周炎+应激组大体标本改变

Figure 6.The histological changes of periodontal tissues (HE staining, ×400). A: control group (8 weeks); B: stress group (8 weeks); C: periodontitis group (8 weeks); D: periodontitis+stress group (8 weeks); E: HBO treated group (10 weeks)．Black arrows: teeth; red arrows: periodontium; blue arrows: alveolar bone.

图6各组大鼠牙周组织的HE 染色结果

2GI及 AL的变化

2.1GI各组牙龈指数变化见表1。其中单纯应激组GI在各时点与正常对照组比较差异均无统计学显著性。牙周炎组和牙周炎+应激组GI在各个时点明显高于正常对照组和单纯应激组(P<0.01)。牙周炎组和牙周炎+应激组随时间延长GI明显加重(P<0.01)；与牙周炎组比较，在4、8 周末，牙周炎+应激组GI明显高于牙周炎组(P<0.01)。经HBO治疗后，各组GI值降低，与未治疗组比较差异有统计学显著性(P<0.05)。

表1　各实验组和对照组大鼠牙龈指数的变化

◇P<0.01vscontrol group;◆P<0.01vsperiodontitis+stress group;▲P<0.01vs4 weeks group;▼P<0.05vsuntreated group.

2.2 AL的变化牙周附着丧失变化情况见表2。结果显示单纯应激组AL在各时点与正常对照组比较差异均无统计学显著性。牙周炎组和牙周炎+应激组AL在各个时点明显高于正常对照组和单纯应激组(P<0.01)；在第4、8周末牙周炎+应激组AL明显高于牙周炎组(P<0.01)。牙周炎组和牙周炎+应激组随时间延长AL明显加重(P<0.01)；HBO治疗后AL水平明显下降，与未治疗组差异有统计学显著性(P<0.05)。

表2　各实验组和对照组大鼠牙周附着丧失的变化

◇P<0.01vscontrol group;◆P<0.01vsperiodontitis+stress group;▲P<0.01vs4 weeks group;▼P<0.05vsuntreated group.

3HIF-1α免疫组化染色结果

HIF-1α免疫组化阳性信号主要定位于细胞浆或细胞核，为棕黄色细小颗粒状。正常对照组及单纯应激组中只有少数细胞HIF-1α呈弱阳性表达，牙周炎组有较多细胞HIF-1α表达呈阳性，牙周炎+应激组大量细胞HIF-1α表达呈强阳性，HBO治疗后HIF-1α阳性细胞减少，见图7。

各实验组平均阳性HIF-1α 细胞率见表3。统计结果表明正常对照组在各时点与单纯应激组比较差异均无统计学显著性。牙周炎组和牙周炎+应激组平均阳性细胞率在各个时间点明显高于正常对照组和单纯应激组(P<0.01)。在第4、8周末牙周炎+应激组平均阳性细胞率明显高于牙周炎组(P<0.01)。牙周炎组和牙周炎+应激组，在第8周末平均阳性细胞率明显高于第4周(P<0.01)。HBO治疗后平均阳性细胞率下降，与未治疗组比较差异有统计学显著性(P<0.01)。

讨论

牙周炎是口腔最常见的疾病之一，通过破坏牙周支持组织进而导致牙齿缺失。现代医学认为牙周炎的病因十分复杂，除牙周致病菌外，牙周炎的发展及严重程度还与心理因素(如焦虑、应激、压力、沮丧等)有关。在应激状态下，组织氧分压降低[5]、糖皮质激素分泌增加致使机体免疫功能减弱[6]、胰岛素耐受性升高等都会增加牙周疾病发生发展的风险[7]。目前尚未有研究证实心理应激是否通过扰乱组织的氧代谢进而影响牙周疾病。本实验选取了3种应激方案(限制性应激、浸泡冷水应激、猫惊吓应激)于实验开始后每天随机选择上述3种应激方案中的一种，以模拟现实社会应激源的多样性和不可预料性，建立应激模型进行研究。

Figure 7.Immunostaining for HIF-1α protein in rat periodontia (×400). A: control group (8 weeks, scored -); B: stress group (8 weeks, scored 1+); C: periodontitis group (8 weeks, scored 2+); D: periodontitis+stress group (8 weeks, scored 5+); E: HBO treated group (10 weeks, scored 1+).

图7各组大鼠牙周组织的HIF-1α免疫组化染色结果

表3　各实验组和对照组HIF-1α表达的平均阳性细胞率

◇P<0.01vscontrol group;◆P<0.01vsperiodontitis+stress group;▲P<0.01vs4 weeks;▼P<0.01vsuntreated.

本实验研究结果显示：单纯应激组GI、AL在各时点与正常对照组比较差异均无统计学显著性；牙周炎+应激组GI、AL明显高于牙周炎组，组织学观察见单纯应激组无明显牙周破坏，牙周炎+应激组牙周组织破坏程度在各时点均重于牙周炎组，表明单纯的应激刺激不会导致明显的牙周炎症，心理应激能明显造成牙周炎症状加重。有临床调查研究表明，处于心理应激状态的人群更容易检测到附着丧失和牙槽骨吸收[8-9]，本实验结果显示，心理应激加重了牙周附着丧失和和牙槽骨吸收，与其它学者研究结果一致，分析其机制有以下几点：机体应激反应可导致Th1/Tp 平衡失调，产生儿茶酚胺、肾上腺皮质激素等，抑制细胞免疫应答、促进体液免疫应答，从而影响炎症的发生与进展[10]；同时，由浆细胞分泌的SIgA在口腔局部免疫中起重要作用，能中和细菌毒素、抵抗细菌感染并且抑制菌斑粘附在牙面。应激能引起唾液中SIgA含量下降[11-12]，使机体患牙周疾病的机率增加[13]；应激还会引起免疫细胞的改变，如抑制NK细胞活性、白细胞总数增多，淋巴细胞数相对减少，中性粒细胞相对增高，巨噬细胞减少，阻碍巨噬细胞吞噬功能以及巨噬细胞向炎症区域聚集等[14]。NK细胞以及巨噬细胞活性低下可能也是应激影响牙周炎症的原因之一；应激通过中枢神经系统和免疫、内分泌系统对细胞因子及其他炎症调节因子(如IL- 1、IL- 6、NO等)都会产生影响，在牙周炎症中起重要作用且与牙周炎的严重程度有关[15]。但是，当牙周处于健康状态时，由于机体正负反馈的对抗性调节，使应激产生的各项变化不致于出现强烈且持久的病态反应。

HIF-1包括α、β两个亚基，是参与调控机体缺氧适应性反应的异质二聚体转录因子[16]。其中，HIF-1α是细胞低氧适应与应答调节的关键因子，在正常氧含量状态下不易检测，在缺氧诱导下表达增强，因此HIF-1α在组织局部的表达情况可作为评价组织缺氧情况的指标。本实验结果观察到，在各时间点单纯应激组HIF-1α平均阳性细胞率低且与正常对照组比较差异无统计学显著性；在第4、8 周时牙周炎+应激组平均阳性细胞率明显高于牙周炎组。本实验结果表明单纯的应激刺激不会影响牙周组织的氧代谢，但在炎症状态下应激刺激可加重牙周病变组织的缺氧程度，从而加重牙周炎。其机制可能是由心理应激介导的一系列的代谢和心血管代偿(如调节心律和外周血管阻力、抑制胰岛素分泌、刺激胰高血糖素的分泌等)，导致外周微血管收缩，微循环血液流量减少，从而导致组织缺血缺氧[17-18]。除与缺氧有关之外，有学者的研究推测HIF-1α可能还与炎症反应的调控、肿瘤细胞增殖以及细胞凋亡等有关[19-20]。Cramer等[21]发现在髓样细胞HIF-1基因缺陷的炎症模型与HIF-1基因无缺陷的炎症模型相比基本无炎症渗出。由此推断炎症区域氧浓度降低，髓样细胞HIF-1α蛋白浓度上升， HIF-1α进入细胞核调控炎症细胞的能量代谢，使糖酵解产生ATP 增加。当HIF-1α不足时，髓样细胞能量代谢受阻使得炎性渗出显著下降，提示HIF-1α可参与调节炎症区域微环境的作用。

HBO治疗可增加牙周组织局部氧含量，单独使用或与龈上洁治术、龈下刮治术、翻瓣术等其他牙周治疗手段联合使用，均有一定的治疗效果。龈下菌斑中的致病微生物主要为厌氧菌，是导致牙周病发病的最重要因素，在各种牙周病的发生发展当中起重要作用[22-23]。研究发现高压氧可以抑制人类和动物的牙周袋中的厌氧菌的生长，改善牙龈的微循环和增加牙龈血流量[24]，刺激血管再生，促进成纤维细胞和成骨细胞的增殖，促进了新骨的形成以及抑制牙槽骨的吸收，提高牙周组织的修复能力，对于牙周炎的治疗很有帮助。Yoblon等[25]报道，骨折的大鼠暴露于0.3 MPa的氧压下每天两个疗程，每次1 h，在40 d之后有大量的骨膜下新骨的形成，提示高压氧可以促进新生骨的形成。本实验自实验后第9周起进行HBO治疗，连续治疗2周。HBO治疗结束后，大体观察见牙龈无明显水肿，探诊见牙周袋变浅；组织学观察牙周组织炎症破坏减轻，炎症细胞减少，与多数学者的研究结果一致[26-27]。同时，本实验观察到牙周炎组及牙周炎+应激组GI、AL均减轻，HIF-1α平均阳性细胞率降低，结果表明HBO疗法对纠正牙周炎症时组织的缺氧状态有一定作用，对心理应激相关牙周炎具有明显疗效。本研究结果显示HBO治疗后大鼠牙周附着水平基本恢复至正常水平，与上述原因有关，但具体的机制仍需进一步研究。

综上所述，本实验通过建立大鼠牙周炎模型，并给予心理应激刺激，结果显示在炎症状态下，心理应激可能通过加重牙周组织的缺氧程度，干扰正常的氧代谢，从而加重牙周组织破坏程度。在缺氧状态下，HIF-1α表达增加可能也参与了炎症调控、细胞凋亡等过程。HBO疗法能显著改善牙周病的缺氧状态，减轻牙周炎症程度，对缓解心理应激性牙周炎有较好的疗效，在制定治疗方案时为心理应激性牙周炎提供了新的治疗思路和治疗依据。

[参考文献]

[1]Thornton-Evans G, Eke P, Wei L, et al. Periodontitis among adults aged ≥30 years-United States, 2009-2010[J]. MMWR Surveill Summ, 2013, 62 (Suppl 3):129-135.

[2]Evers AW, Verhoeven EW, van Middendorp H, et al. Does stress affect the joints? Daily stressors, stress vulnerability, immune and HPA axis activity, and short-term disease and symptom fluctuations in rheumatoid arthritis[J]. Ann Rheum Dis, 2014, 73(9):1683-1688.

[3]Rosania AE, Low KG, McCormick CM, et al. Stress, depression, cortisol, and periodontal disease[J]. J Periodontol, 2009, 80(2):260-266.

[4]Löe H. The Gingival Index, the Plaque Index and the Retention Index Systems[J]. J Periodontol, 1967, 38(6):610-616.

[5]Deinzer R, Hilpert D, Bach K, et al. Effects of academic stress on oral hygiene： a potential link between stress and plaque-associated disease?[J]. J Clin Periodontol, 2001, 28(5):459-464.

[6]Morand EF, Leech M. Glucocorticoid regulation of inflammation: The plot thickens[J]. Inflamm Res, 1999, 48(11):557-560.

[7]Björntorp P, Holm G, Rosmond R. Hypothalamic arousal, insulin resistance and type 2 diabetes mellitus[J]. Diabet Med, 1999, 16(5):373-383.

[8]Pistorius A, Krahwinkel T, Willershausen B, et al. Relationship between stress factors and periodontal disease[J]. Eur J Med Res, 2002, 7(9):393-398.

[9]Parwani R, Parwani SR. Does stress predispose to periodontal disease?[J]. Dent Update, 2014, 41(3):260-264, 267-268, 271-272.

[10]Hart A, Kamm MA. Review article: mechanisms of initiation and perpetuation of gut inflammation by stress[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2002, 16(12):2017-2028.

[11]Bosch JA, Brand HS, Ligtenberg TJ, et al. Psychological stress as a determinant of protein levels and salivary-induced aggregation of Streptococcus gordonii in human whole saliva[J]. PsychosomMed, 1996, 58(4):374-382.

[12]Teeuw W, Bosch JA, Veerman EC, et al. Neuroendocrine regulation of salivary IgA synthesis and secretion: implications for oral health[J]. Biol Chem, 2004, 385(12):1137-1146.

[13]Hägewald S, Bernimoulin JP, Köttgen E, et al. Salivary IgA subclasses and bacteria-reactive IgA in patients with aggressive periodontitis[J]. J Periodontal Res, 2002, 37(5):333-339.

[14]Shapira L, Frolov I, Halabi A, et al. Experimental stress suppresses recruitment of macrophages but enhanced theirP.gingivalisLPS-stimulated secretion of nitric oxide[J]. J Periodontol, 2000, 71(3):476-481.

[15]Leitão RF, Rocha FA, Chaves HV, et al. Locally applied isosorbide decreases bone resorption in experimental periodontitis in rats[J]. J Periodontol, 2004, 75(9):1227-1232.

[16]Jewell UR, Gassmann M. Mammalian gene expression in hypoxic conditions[J]. Zoology (Jena), 2001, 104(3-4):192-197.

[17]黄世光，王晓歌，潘倩茹，等. 慢性心理应激对大鼠实验性牙周炎及血清乳酸脱氢酶1的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2012, 28(5):924-928.

[18]Henderson B. Integrating the cell stress response: a new view of molecular chaperones as immunological and physiological homeostatic regulators[J].Cell Biochem Funct, 2010, 28(1):1-14.

[19]刘金波，方飞，易娟，等. 人牙髓组织缺氧耐受机制的初步研究[J]. 临床口腔医学杂志, 2007, 23(5):277-279.

[20]吴裕丹，倪嘉延，陈耀庭，等. 沉默HIF-1α基因表达对大鼠肝癌细胞增殖的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2013, 29(7):1207-1212.

[21]Cramer T, Yamanishi Y, Clausen BE, et al. HIF-1α is essential for myeloid cell-mediated inflammation[J]. Cell, 2003, 112(5):645-657.

[22]Kolaparthy LK, Sanivarapu S, Swarna C, et al. Neutrophil extracellular traps: their role in periodontal disease[J]. J Indian Soc Periodontol, 2014, 18(6):693-697.

[23]Schmidt J, Jentsch H, Stingu CS, et al. General immune status and oral microbiology in patients with different forms of periodontitis and healthy control subjects[J]. PLoS One, 2014, 9(10):e109187.

[24]Chen TL, Xu B, Liu JC, et al. Effects of hyperbaric oxygen on aggressive periodontitis and subgingival anaerobes in Chinese patients[J]. J Indian Soc Periodontol, 2012, 16(4):492-497.

[25]Yablon IG, Cruess RL. The effect of hyperbaric oxygen on fracture healing in rats[J]. J Trauma, 1968, 8(2):186-202.

[26]陈铁楼, 蔺世龙, 刘景昌, 等. 高压氧对人重症牙周炎牙龈血流量、血流速度和血浓度作用及机理研究[J]. 微循环学杂志, 2004, 14 (1): 27-28.

[27]Nogueira-Filho GR, Rosa BT, David-Neto JR. Effects of hyperbaric oxygen therapy on the treatment of severe cases of periodontitis[J]. Undersea Hyperb Med, 2010, 37(2):107-114.

(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Effect of hyperbaric oxygen on HIF-1α expression in rat experimental periodontitis with psychological stressWANG Rong, GU Si-cheng, GUO Jian-fen, HUANG Shi-guang

(FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thshg@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of hyperbaric oxygen (HBO) on hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) expression in rat experimental periodontitis with psychological stress. METHODS: Male special pathogen-free Wistar rats (n=120) were randomly divided into 4 groups: normal control group; psychological stress stimulation group; experimental periodontitis group: the periodontitis model was induced by wrapping 3/0 silk ligature inoculated withPorphyromonasgingivalisaround the left maxillary second molar of the rats; periodontitis model with stress stimulation group. Psychological stress was removed at the 9th weeks after ligature, 6 rats from each experiment group were randomly chosen to HBO treatment. The rats were sacrificed at the 2nd， 4th， 8th and 10th weeks after ligature. Gingival index (GI) and attachment loss (AL) were measured before sacrifice. The histological changes of periodontal tissues were observed under microscope with HE staining. The expression of HIF-1α was observed by the method of immunohistochemistry. RESULTS: The sites of gingival attachment were normal in control group and psychological stress stimulation group. Periodontal pocket, and periodontal attachment loss were observed in experimental periodontitis group. The tissue damage was much serious in periodontitis model with stress stimulation group. No significant difference of GI and AL among psychological stress stimulation group and normal control group during the experiment was observed. GI and AL in periodonitis model with stress stimulating group were significantly higher than those in experimental periodontitis group at the 4th and 8th weeks (P<0.01). The levels of GI and AL were significantly lower at the 10th weeks after HBO treatmnt than those in untreated groups (P<0.05). No significant difference of HIF-1α expression scores among psychological stress stimulation group and normal control group was found. HIF-1α expression scores in periodonitis model with stress stimulating group was significantly higher than that in experimental periodontitis group at the 4th and 8th weeks (P<0.01). At the 10th weeks after HBO treatment the levels of HIF-1α were significantly lower than that in untreated groups (P<0.01). CONCLUSION: Stress stimulation may aggravate periodontitis by decreasing tissue oxygenation in rats. HBO may represent a useful way in psychological stress periodontitis therapy.

[KEY WORDS]Periodontitis; Psychological stress; Hyperbaric oxygen; Hypoxia-inducible factor-1α

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.025

[中图分类号]R363； R781

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com

*[基金项目]广东省社会发展领域科技计划项资助项目(No.2013B021800043； No.2014A020212212)

[收稿日期]2015- 07- 07[修回日期] 2015- 12- 14

[文章编号]1000- 4718(2016)02- 0339- 08