李孜孜

[摘要] 目的 保证活检组织标本脱水和浸蜡的质量，减少试剂的损耗，制作优质的石蜡组织块。 方法 2013年11月～2015年7月使用全自动脱水机的脱水过程中，通过试剂更换和管道清洗，以及对脱水机使用、维护、保养和常见故障排除等方面进行探讨。 结果 活检标本处理质量高，HE 染色后形态清晰。维持了组织原有的形态和最接近细胞生存状态中的蛋白质和DNA，为免疫组织化学、特殊染色、分子病理等技术方法奠定基础。 结论 脱水是病理技术中的重要环节，需要技术人员高度的责任心，并通过观察总结出一套适合本科室工作的脱水方法和流程。

[关键词] 病理制片；活检标本；固定液；脱水试剂；HE染色

[中图分类号] R361.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）25-0109-03

Automatic dehydration method and improvement of pathological biopsy tissue

LI Zizi

Department of Pathology， the Fifth Hospital Affiliated to SunYat-sen University， Zhuhai 519000， China

[Abstract] Objective To ensure the quality of dehydrated and paraffin wax， reduce the loss of the reagent， and make the high quality paraffin block. Methods From November 2013 to July 2015， the dehydration process of the automatic dehydration machine， the use of reagent and pipeline cleaning to discuss the use， maintenance， maintenance and common trouble shooting of the dewatering machine. Results The quality of the biopsy specimen was improved， and the morphology of HE staining was clear. To maintain the original form of the organization and the most close to the cell viability of the protein and DNA， as the immune tissue chemistry， special staining， molecular pathology and lay the foundation for other technical methods. Conclusion Dehydration is an important part in the pathology technology， it needs a high degree of responsibility， and a summary a practical system for this work.

[Key words] Pathological section； Biopsy； Formalin； Dehydrator； HE stain

随着医院门诊及手术量的增加，越来越多的医生会对患者进行活体组织检查，希望能通过此项检查给予疾病明确的诊断，并对于后续的治疗给予正确的方向。随着病理技术的进一步发展，对组织标本的处理要求日益提高，其中包括免疫组织化学检查以及个性化、私人订制的分子病理检查。目前也是在脱水后的石蜡包埋标本上进行制作，因此保持活体组织的形态、保存细胞中的蛋白质和DNA显得尤其重要。全自动密闭式组织脱水机是目前广大医院脱水的基本设备，是病理技术工作的重要组成部分。高质量的处理标本，减少故障率，维持脱水机的正常运转，以至于每日取材标本都能按时制片，最终能才够确保病理报告的按时发出，因此显得尤为重要[1]。

组织脱水过程是一个物理化学变化的过程，乙醇作为脱水剂，是因为乙醇易溶于水，能与水以任何比例混合。组织浸泡在乙醇后，组织内水分被乙醇所替代。组织在梯度酒精内完全脱水后，通过二甲苯作为媒介，置换出组织中的乙醇，然后被融化的石蜡所填充。

1 资料与方法

1.1 材料与仪器

我院活检标本和外科手术标本。仪器：Thermofisher Excelsior ES型全自动密闭式组织脱水机，每台附带不锈钢脱水篮1只，可容纳300个包埋盒，塑料包埋盒为国内产品。我们科室在2013～2015年购置了Thermofisher Excelsior ES脱水机，使用过程中在科学理论指导下，联系实际，总结出一套适合广东气候和本科室工作程序的脱水程序。

1.2 方法

标本取材后放入脱水机，总时间为13 h。该脱水程序，适合内镜标本、皮肤标本以及手术标本。脱水设置程序为4%中性甲醛Ⅰ30 min、4%中性甲醛Ⅱ45 min、70%乙醇45 min、80%乙醇45 min、95%乙醇60 min、95%乙醇75 min、无水乙醇Ⅰ90 min、无水乙醇Ⅱ90 min、二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、二甲苯Ⅲ20 min、石蜡Ⅰ60 min、石蜡Ⅱ90 min、石蜡Ⅲ90 min[2-4]。

1.2.1 初次固定 采用10%中性缓冲福尔马林浸泡标本。其使用广泛，易于配制，穿透速度快，组织硬化程度小。保存细胞的基本形态，维持接近细胞生活状态的蛋白质和DNA且细胞核和细胞质的微细部分均保存良好，也可进行免疫组化染色。我们科室在收到当天的门诊活检标本或手术标本均固定至次日，待标本充分固定后再取材。

1.2.2 二次固定 取材时也将取好的组织块放置于10%中性缓冲福尔马林，这样在取材的数小时中可以让标本进一步的固定，让处于标本深部地方充分固定[5]。

1.2.3 三次固定 取材结束后，将标本放置入全自动脱水机中继续固定，我们科室常用AAF 液（甲醛150 mL、95%乙醇800 mL、冰醋酸50 mL 配成1000 mL），固定时间为2 h[6]。

1.3 观察指标

经过自动脱水机处理较好的组织，颜色呈均匀淡黄色、硬度适中、无发白区、放置一段时间后组织无凹陷、适宜包埋和切片[7]。制作出的切片完整、厚度适宜、核深色清晰、核质分明、透明度好。用于制作HE染色、特殊染色、免疫组织化学染色、分子病理等，利于医师判读和诊断[8]。优质切片质控指标见表1。

表1 优质切片质控指标

2 结果

2.1 处理效果

经该程序处理的组织标本脱水、透明和浸蜡充分，软硬适中，有弹性，效果好，组织切片厚2～3 μm。制作的切片达到优质切片质量标准，优质切片每项分数都要求达到90%以上[9]。

2.2 HE染色色彩明亮

颜色鲜艳，苏木素和伊红颜色分明，细胞核结构清晰，尤其是内镜和穿刺标本组织等细小标本中制作优良着色佳[10]。

2.3 特殊染色阳性色彩突出

阳性结果反应颜色易于区分和识别，层次清楚，对比明显。

2.4 免疫组织化学染色、特异性染色区域和阴性区域分明[11]

组织切片中棕黄色反应产物着色清晰可见，上色均匀，阴阳对比明显。

2.5 分子病理利于DNA的扩增和探针的杂交

DNA结构保存完好，信号强度清晰，易于判读。

2.6 故障率降低

在使用的3年时间内，脱水机故障率为零。

2.7 脱水效果

不同染色HE染色比较示例[12]。①腺瘤性息肉标本：图1脱水效果不佳，细胞结构不清，不利于诊断；图2脱水效果佳，细胞结构清晰，诊断较明确。②鼻咽未分化型非角化性癌标本：图3脱水效果不佳，透明度不好，不利于诊断；图4脱水效果佳，颜色分明，核清晰，诊断较明确。

3 讨论

组织处理几点重要因素：固定应及时、脱水要彻底、透明宜充分、浸蜡需足够。

3.1 固定组织固定的目的

固定组织固定的目的在于保存组织基本结构和形态，是脱水的第一步也是最关键的一步。固定不佳的组织形态模糊不清，免疫组织染色不佳[13]。活检组织离体后要尽快放置进入固定液。这样不仅可以防止组织的自溶改变，而且还可以防止组织中的蛋白质和DNA分解和变性。所以，固定标本尤其是固定大块或条索状标本时要尽可能的保持标本正常时的状态，不得发生扭曲。淋巴结等不易固定透的组织要切开固定。组织最佳的固定时间为12～72 h。

3.2固定试剂的更换

二次固定液每天更换，三次固定液使用满1000组织块就需更换一次。每次更换时Thermofisher Excelsior ES脱水机共有两道固定液，每次更换固定液Ⅰ，然后将固定液Ⅱ向前挪，再将新配置的AAF固定液放在固定液Ⅱ缸中。

3.3 脱水试剂的更换

本科室梯度酒精1个月更换1次，一般能处理4000个组织块，基本方法为轮换下第一道酒精，后面的酒精依次向前挪。二甲苯也1个月更换1次，将二甲苯Ⅰ排出，将二甲苯Ⅱ向前挪，在空置的二甲苯Ⅱ缸中放入新的二甲苯。

3.4 石蜡的更换

本科室的石蜡为4～5周更换1次，时间在更换酒精和二甲苯之后，同样也是将第一道石蜡排出，将后续的石蜡一次向前挪，在最后一道中加入新的石蜡。气温高加入多一些的硬蜡，气温低加入多一些的软蜡。石蜡更换也可凭技术人员的细心观察而定，例如石蜡稀呈水样，浸蜡不充分，并附着较大的二甲苯气味，就应该及时更换石蜡[14]。

3.5 冲洗

标本取出后，及时冲洗。为了避免管道的堵塞和试剂的相互混合，冲洗液及水每周都需要更换。每天冲洗完毕，放入标本处理缸先用纸巾将冲洗残留液体擦干净，避免冲洗液和AAF固定液的混合，影响固定效果。并且，将标本处理缸的感应探头擦干净，是感应探头准确测量试剂的浓度，避免错报。每天排蜡完毕取出标本时，应用纸巾将标本处理缸擦干净再经行冲洗，这样可减少管道堵塞的机会。

3.6 脱水机责任到人

负责人负责试剂的更换和添置，每天放置标本完毕之后检查试剂的页面是否正常，蜡缸是否需要添置。并做好相关问题的记录，避免问题的发生。登记每天的蜡块数，密切关注组织块的脱水情况。

3.7 脱水机的定期保养和维护

盖板密封圈表面和周围有石蜡残留，产生漏气现象，要留意密封圈的密封性能，如有破损，及时更换。脱水机内部的塑胶管道使用一年半左右需更换，以免破损导致机器停工[15]。过滤网有残渣吸附，试剂交换受阻。要定期的清理。最好能够定期请厂家为脱水机进行故障的排查。

综上，在日常工作中脱水机的正常运行，试剂的浓度适宜，脱水的程序时间适中，才能将活检组织脱水充分，成为制作优质病理切片最关键也是最基础的一步。

[参考文献]

[1] 周洁. 自动组织脱水机的应用体会[J]. 实用医技杂志，2007，（16）：2181-2182.

[2] 周小鸽，刘勇，主译. 组织学技术的理论与实践[M]. 第6 版. 北京：北京大学医学出版社，2010：72-77.

[3] 梁英杰，凌启波，张威. 临床病理学技术[M]. 北京：人民卫生出版社，2011：12-13.

[4] 赵宝忠，张立华，李恩鸿. 病理组织脱水剂及组织脱水工艺的再认识[J]. 临床与实验病理学杂志，2011，27（4）：438-439.

[5] 胥颖，何娟，徐科伟，等. 樱花全自动密闭式组织脱水机应用体会[J]. 实用医院临床杂志，2012，（6）：180-181.

[6] 王华. 影响组织脱水质量的常见问题探讨[A]. //浙江省医学会病理学分会病理技术学组. 2013年第三届长三角地区病理技术新进展研讨会暨浙江省第八次病理技术会议论文汇编[C]. 浙江省医学会病理学分会病理技术学组，2013.

[7] 罗添友，秦巍笈，唐源. Leica Peloris全自动脱水机在小组织快速处理技术中的应用体会[J]. 临床与实验病理学杂志，2014，30（10）：1199-1200.

[8] 郭海燕，王志生，王亦飞，等. 病理切片制作过程中常见问题及处理对策[J]. 中国继续医学教育，2015，（9）：184.

[9] 管桂杰，董祥梅，姚慧欣. 微小活检组织在自动脱水机中运行方式的改进[J]. 中国医疗设备，2012，（4）：102-103.

[10] 吴清萍. 胃粘膜活检422例病理制片分析[J]. 中国保健营养，2013，（8）：1673.

[11] 邓学军. 免疫组织化学染色的影响因素及质量控制的应用研究[J]. 数理医药学杂志，2015，（1）：105.

[12] 范慧，苏贞辉，柳通，等. 组织脱水机处理不当导致切片不着色的补救方法[J]. 临床与实验病理学杂志，2015， 31（4）：472-473.

[13] 马恒辉，周晓军. 组织固定处理及包埋常见问题与对策[J]. 临床与实验病理学杂志，2011，26（6）：638.

[14] 郑晖，颜亚晖，朱文兵. 全自动组织脱水机试剂的更换[J].诊断病理学杂志，2010，17（5）：399.

[15] 沈国平. 电脑自动组织脱水机TSJ-III故障排除及体会[J]. 临床医药文献电子杂志，2014，（13）：2364.

（收稿日期：2015-07-09）