靳颖+王俊妨+周鑫+等

[摘要] 目的 探讨血清（1，3）-β-D-葡聚糖对深部真菌病的诊断价值。 方法 将2014年2～6月天津市武警后勤学院附属医院110份数据（标本140份）分为侵袭性真菌病患者组33例和无侵袭性真菌病组77例，分析比较葡聚糖水平，并使用ROC曲线确定最佳临界值。 结果 侵袭性真菌病患者组的葡聚糖水平（279.78±83.26）pg/mL，明显高于对照组（34.05±9.35）pg/mL（P<0.001）；ROC曲线下面积为0.946（95%的置信区间为0.904～0.988），当以95.20 pg/mL为临界值时，实验的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为84.8%、93.5%、80.0%和93.3%；临床符合率达到89.1%。Kappa值0.784（P<0.05）。 结论 血清葡聚糖水平可以用于深部真菌感染的诊断，本研究中用北京金山川公司的GKT-1M Set动态真菌检测试剂盒检测血清葡聚糖水平，进行深部真菌感染诊断时的最佳临界值为95.20 pg/mL，当以此临界值对深部真菌感染进行诊断时，临床一致性较好。

[关键词] 深部真菌病；诊断；血清1，3-β-D-葡聚糖；ROC曲线

[中图分类号] R392.7 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）25-0102-03

Study on diagnostic value of serum （1，3）-β-D-Glucan detection for deep fungal disease

JIN Ying WANG Junfang ZHOU Xin WANG Hongzhi

Clinical Laboratory Department， Affiliated Hospital of Armed Police Logistics，Tianjin 300162， China

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic value of serum（1，3）-β-D-glucan for deep fungal disease. Methods 110 copies of data（140 specimens） of affiliated hospital of tianjin Armed Police logistics academy from February to June 2014 were divided into the invasive fungal disease group with 33 copies and the non-invasive fungal disease group with 77 copies. The glucan levels were analyzed and compared. The ROC curve was used to determine the optimal critical value. Results The glucan level of the invasive fungal disease group was （279.78±83.26） pg/mL， which was significantly higher than the（34.05±9.35）pg/mL of the control group（P<0.001）. The ROC area under curve was 0.946（95% confidence interval was 0.904-0.988）； When 95.20 pg/mL was used as the critical value， the sensitivity， specificity， positive predictive value and negative predictive value of experiment were 84.8%， 93.5%， 80.0% and 93.3%. The clinical accordance rate reached 89.1%. The Kappa value was 0.784 （P<0.05）. Conclusion The serum glucan level can be used for the diagnosis of deep fungal infection. This study uses the GKT-1M Set dynamic fungal detection kit of Beijing Jinshan Company to detect the serum glucan level. The optimal critical value for deep fungal infection diagnosis is 95.20 pg/mL and when this critical value is used for the diagnosis of deep fungal infection， the clinical consistency is better.

[Key words] Deep fungal disease； Diagnosis； Serum 1，3-β-D-glucan； ROC curve

现今，尽管存在有效的治疗方法，但是侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD）仍然是免疫抑制患者发病和死亡的重要原因[1]。及时、准确的诊断是非常必要的，但是由于非特异性的临床和影像结果、低敏感性的培养方法等[2]，诊断又面临着诸多挑战。非培养血清抗原诊断方法，如（1，3）-β-D-葡聚糖检测（G实验）和半乳甘露聚糖检测（GM实验）等则使得IFD的早期诊断成为可能[3]。本研究中，我们应用MB-80微生物快速动态检测系统，调查了血清（1，3）-β-D-葡聚糖（G实验）在侵袭性真菌病方面的诊断作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析天津市武警后勤学院附属医院2014年2～6月确诊侵袭性真菌病患者33例（其中男15例，年龄52～90岁；女18例，年龄29～81岁），平均64岁，对照组77例（其中男41例，女36例），平均年龄59岁。相关诊断标准参照欧洲肿瘤研究治疗组织（EORTC）和真菌病研究组（MSG）对侵袭性真菌病的定义和分类进行判断[4]，整个过程结合临床，患者出院后进行病例分析总结。

1.2 试剂与仪器

GKT203真菌检测试剂盒（定量）、MB-80微生物快速动态检测系统、T02智能恒温仪，均由北京金山川科技发展有限公司提供。

1.3 标本采集

两组均在早晨空腹用药前采血，分别送血清葡聚糖检测和真菌血培养，根据临床症状，对于高度疑似患者同时进行组织病理学检查。取样过程尽量保证无菌无热原，血培养时将标本接种于标准真菌培养基。最后留取用于检测血清（1，3）-β-D-葡聚糖的标本110 份，其中确诊和高度疑似病例33份，对照组77 份。

1.4 血清（1，3）-β-D-葡聚糖的检测（G实验）

使用无菌无热原真空血清采血管取4 mL静脉血，3000转每分钟离心10 min，得到血清标本，取血清标本上层清液100 μL，加入到900 μL的样品处理液中，摇匀，放入T02智能恒温仪，70℃加热10 min，转移到冷却区冷却5 min，得到处理后的待测样本。取200 μL上述处理后的样本，加入到反应主剂中，混匀后全量转移至无热原平底试管中，一次性插入MB-80微生物快速动态检测系统，反应1.5 h系统自动计算结果并保存。厂家提供的真菌葡聚糖阳性判断值为100 pg/mL。

1.5 统计学分析

应用统计软件包SPSS11.0 进行统计学分析，确诊及高度疑似组、健康组的血清葡聚糖水平记录为[x±s（中位数）]形式，使用独立样本t检验，P<0.05差异具有统计学意义。另绘制血清（1，3）-β-D-葡聚糖水平、真菌血培养、组织病理学检查结果的ROC曲线（受试操作特征曲线），根据该方法对敏感度和特异度的要求，确定血清（1，3）-β-D-葡聚糖检测用于诊断侵袭性真菌病的最佳临界值，使用一致性检验Kappa值，判断一致性符合度，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清（1，3）-β-D葡聚糖水平比较

侵袭性真菌病患者组的葡聚糖水平[（279.78±83.26）（192.10）pg/mL，方差为69687.40 pg/mL2（其中念珠菌感染者平均水平198.33 pg/mL，曲霉感染者平均水平232.9 pg/mL，明显高于对照组的葡聚糖水平（34.05±9.35）（18.87）pg/mL，方差为1450.91（pg/mL）2。独立样本t检验的统计值：t=8.023，P<0.05差异有统计学意义。

2.2 真菌培养和组织病理学检查结果

33例确诊和高度疑似深部真菌病患者中，血清（1，3）-β-D-葡聚糖检测28例阳性，5例阴性。血培养出22例阳性，其余11例通过组织病理学确诊。血培养结果：白色念珠菌11例，光滑念珠菌5例，克柔念珠菌2例，近平滑念珠菌2例，季也蒙念珠菌2例；组织病理学检查黄曲霉3例，组织胞浆菌2例，黑曲霉2例，毛霉菌2例，烟曲霉1例，念珠菌1例。

2.3 血清（1，3）-β-D葡聚糖检测的敏感性和特异性

血清葡聚糖用于诊断侵袭性真菌病ROC曲线下面积为0.946（渐进95%的置信区间为0.904～0.988），见图1。

图1 血清葡聚糖用于诊断侵袭性真菌病ROC曲线

不同血清葡聚糖水平作为临界值时的敏感度和特异度见表1。当以95.20 pg/mL为临界值时，本方法对侵袭性真菌病的诊断敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为84.8%、93.5%、80.0%和93.3%，效果较为理想。

表1 不同血清葡聚糖水平作为临界值时的敏感度和特异度

3 讨论

近年来，由于免疫抑制剂和广谱抗生素以及抗肿瘤药物的大量使用，侵袭性真菌病的发病率不断增加[5]，同时由于缺少早期诊断方法，延迟了真菌药物治疗，部分侵袭性真菌病在尸检时才能诊断出来，导致IFD的病死率逐年升高。真菌血培养是侵袭性真菌病的传统诊断手段，可明确诊断结果并进行相应的药敏试验，但阳性率很低，组织病理学检测往往需要侵入性手段获得标本[6]。因此侵袭性真菌病的早期快速准确诊断显得尤为重要。

血清（1，3）-β-D-葡聚糖检测（G实验）敏感度和特异度较高，可早期快速明确是否具有深部真菌感染[7]。在欧洲癌症治疗研究组织/真菌病研究组（EORTC/ MSG）诊断侵袭性真菌病的标准中，已经将G试验连续2次阳性结果作为阳性判断标准[4]。（1，3）-β-D-葡聚糖是许多真菌细胞壁的主要成分，占真菌细胞壁成分的50%以上，其形式以（1，3）-β-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状（1，3）-β-D-葡聚糖残基作为侧链。这些真菌包括念珠菌、曲霉菌、镰刀菌和肺孢子菌等，而细菌、病毒以及人体细胞中则不含有（1，3）-β-D-葡聚糖。由于（1，3）-β-D-葡聚糖仅特异性存在于真菌的细胞壁中，占真菌细胞壁成分的50%以上，真菌进入人体血液或系统性组织后，经过吞噬细胞的吞噬消化等处理，（1，3）-β-D-葡聚糖可以从真菌细胞壁中释放出来，导致血液和其他体液（如尿、脑脊液、腹水、胸水等）中的葡聚糖含量增高[8]，而在浅部真菌感染中，（1，3）-β-D-葡聚糖不会进入血液等体液中，所以体液中葡聚糖的的量不会增高。当病人患有侵袭性真菌病时，血清中（1，3）-β-D-葡聚糖浓度会明显增高，因此可以根据血清葡聚糖的浓度判断病人是否患病[9]。本研究中，G实验对接合菌和新生隐球菌的感染呈阴性，主要是因为接合菌（包括毛霉和根霉）细胞壁中（1，3）-β-D-葡聚糖含量较少、而新生隐球菌的荚膜较厚，影响（1，3）-β-D-葡聚糖的释放，使得（1，3）-β-D-葡聚糖无法被检测到[10]。

目前国产用于（1，3）-β-D-葡聚糖检测的商品化试剂盒主要以北京金山川科技发展有限公司生产的真菌动态检测试剂盒为主，根据患者临床状况和试剂本身的特点，当以95 pg/mL为临界判断值时，灵敏度和特异度都很好，临床符合率也较高。根据病理组织学，并结合血培养结果是否为阳性判断该方法的敏感度与特异度，本研究认为，使用GKT-1M Set动态真菌检测试剂盒诊断侵袭性真菌病的最佳临界值为（1，3）-β-D-葡聚糖浓度95.20 pg/mL。当以血清（1，3）-β-D-葡聚糖水平95.20 pg/mL为临界值对侵袭性真菌病的诊断敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为84.8%、93.5%、80.0%和93.3%，临床符合率达到89.1%，一致性检验Kappa值为0.748（P<0.05），说明G实验和血培养具有非常好的符合度。

临床工作中侵袭性真菌病患者血清（1，3）-β-D-葡聚糖水平的检测具有其局限性：根据文献报道，G试验出现假阳性的原因包括：①应用纤维素膜进行血液透析[11]；②静脉输注免疫球蛋白[12]；③标本或患者伤口接触纱布或其他含有葡聚糖的物质[13]；④患者伴有较重的溶血（血红蛋白在5.88 g/L以上）；⑤某些链球菌感染会产生葡聚糖或葡聚糖类似物等[14]。此外，其他导致假阳性的因素还需要进一步的证实，如使用香菇多糖类的抗肿瘤药物、放化疗后因为消化道黏膜受损而使食物或肠道定植念珠菌的（1，3）-β-D-葡聚糖进入血液及，接受真菌来源的抗生素治疗等[15]。由于导致G试验假阳性原因较多，所以在G试验的临床应用中，对于阳性的患者，应结合多种诊断手段，综合进行分析[16]，在实验过程中也要引起注意。

国外报道的多中心对照研究表明，侵袭性念珠菌、曲霉菌和镰刀菌感染在相同临界值下的G试验的灵敏度和特异度都较高[17]。在本次研究中，我们的试验结果也证实了这一点。这也提示我们，血清G实验可以广泛应用于除接合菌、隐球菌外多种真菌的检测。

总之，血清中（1，3）-β-D-葡聚糖的水平可用于侵袭性真菌病的诊断。本研究中用北京金山川公司的GKT-1M Set动态真菌检测试剂盒，检测血清中（1，3）-β-D-葡聚糖的水平，最佳临界值为95.20 pg/mL，当以此临界值进行诊断时，临床一致性较好。

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（收稿日期：2015-03-19）