刘彩云，薛佳桢，常志隆

(山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室，潍坊学院生物与农业工程学院，山东　潍坊261061)



龙柏叶枯病的发生特点及其病原菌分离鉴定*

刘彩云，薛佳桢，常志隆

(山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室，潍坊学院生物与农业工程学院，山东潍坊261061)

摘要：龙柏叶枯病是近年来中国园林植物上出现的新病害，以小龙柏受害最为严重。本研究采用田间实地调查、室外试验分析研究了龙柏叶枯病的症状及发生特点，并结合形态学观察及ITS序列分析对分离纯化的龙柏叶枯病的病原菌进行了鉴定。结果表明，龙柏叶枯病受害植株鳞叶小枝从上向下迅速干枯为其典型症状，春季冷凉、多雨的气候条件及强度修剪是该病发生的主要原因；形态学观察及ITS序列分析表明龙柏叶枯病菌的无性时期为链格孢，菌丝为有隔菌丝，分生孢子黄褐色，大小20.5～32.5μm×6.5～10μm，有纵横隔膜且分隔处明显缢缩,有性时期属于子囊菌。

关键词：形态学特征；ITS序列分析；症状；病原；发生特点；链格孢；囊菌

龙柏(Sabinachinensiscv.Kaizuka)别名绕龙柏、螺丝柏，为柏科(Cupressaceae)圆柏属(Sabina)的常绿乔木，是中国城市园林绿化中绿篱、色块和庭院栽植的首选树种之一[1]。2008年，山东胶州龙柏上发生了一种新病害，该病害以受害植株鳞叶小枝从上向下迅速干枯为典型症状，故称之为龙柏叶枯病[23]。此后，该病害在山东省、江苏省均有发生，但目前对其研究报道的文献极少。在2011-2014年，课题组成员对龙柏叶枯病的症状特点、病原、寄主范围、发生特点等进行了调查，并对其病原菌进行分离、鉴定，以期明确该病害的病原菌，为龙柏叶枯病的及时有效防治及深入研究提供参考。

1材料与方法

1.1　症状特点观察

从2011年开始，每年3月中旬，实地观察田间发病龙柏植株，收集病株，记录症状变化特点，并参照植物病害症状描述方法，分析、描述龙柏叶枯病的症状特点。

1.2　病原的分离

采集田间具有叶枯病典型症状特点的龙柏鳞叶小枝，采用组织分离法分离病原菌[4]：先用自来水冲洗小枝，去除其鳞叶上的尘污，再用75 %酒精消毒处理1 min，无菌水冲洗5遍。取23 mm长的消毒后龙柏鳞叶小枝病健交界组织，置于PDA培养基上培养，置于25℃，12 h光照人工智能气候箱中培养，分离、纯化优势菌株。挑取单菌落进行纯化、转管并保存于4℃冰箱中备用。

1.3　病原菌的鉴定

1.3.1形态学鉴定

制作PDA平板，接种分离纯化的致病菌，25℃培养4天后(12 h光照)，置于10℃(12 h光照)条件下继续培养20天左右，刮取菌落上的菌组织，用1 %的葡萄糖制成菌悬液[5]，制作病原菌临时玻片，置于数码相差显微镜上观察病原菌的孢子梗和分生孢子的形态，测量其大小，拍摄照片，根据相关资料进行鉴定[6]。

1.3.2rDNA-ITS序列分子鉴定

PDA培养基活化分离纯化的致病菌，待菌落铺满整个培养皿后，用灭菌刀片刮取菌组织，CTAB法提取病菌基因组DNA，用真菌核糖体基因内转录间隔区(Internal transcribed spacer，ITS) 通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')、ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 进行PCR扩增，扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测后，用TaKaRa琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目标扩增产物，交南京金斯瑞生物科技公司测序。测序结果用与GenBank数据库中已登录真菌的rDNA-ITS序列进行同源性比较，MEGA 4.0软件的Neighbor-joining法构建系统发育树。

1.4　发生特点调查

1.4.1病害发生规律及温湿度对病害发生的影响

从2012年3月上旬开始，实地调查记录潍坊地区龙柏叶枯病的春季发病时间，病害蔓延特点，并在每年的5月下旬对潍坊市区东风街、胜利街、福寿街3条交通主干道两侧绿篱小龙柏，人民公园、白浪河湿地和植物园3个代表性园林景观区绿化色块小龙柏发病情况进行取样调查，统计每个取样点的病株数，计算发病率。发病率=每个取样点的病株数/调查总株数×100 %。根据发病率和当年春季的气候状况，分析温度、降雨量对龙柏叶枯病发生的影响。

1.4.2不同养护管理措施对病害发生的影响

以潍坊学院行道绿篱小龙柏为试验对象，于2012-2014年期间的每年 3月15号开始，采取不同措施对试验区小龙柏进行养护管理，2个月后，比较龙柏叶枯病发病率，评价不同养护管理措施对龙柏叶枯病发生的影响。发病率=每个试验区病株数/该区总株数×100 %。试验采取的养护管理措施分别是：(1)间隔15天修剪1次，不浇水；(2)间隔15天修剪1次，喷灌浇水1次；(3)间隔15天喷灌浇水1次，不修剪；(4)对照区(CK)，植株自然生长，不进行人工浇水与修剪处理。

1.5　数据分析

图4、图5均采用Excel 2007制作，数据差异性采用SAS 8.0软件分析。

2结果与分析

2.1　症状描述

龙柏叶枯病主要危害龙柏叶片，发病初期，植株上部鳞叶小枝端部出现枯黄(图1，A)，并逐渐向小枝基部扩展，导致整个鳞叶小枝呈黄褐色干枯，失去光泽(图1，B)。后期，发病植株鳞叶失水干缩、用手揉捏易碎(图1，C)，大田远远看去似火烧状干枯(图1，D、E)。

图1龙柏叶枯病的症状特点

Fig.1The symptom of leaf blight ofS.chinensiscv. Kaizuka

2.2　病原鉴定结果

2.2.1病原菌的形态特征及鉴定

通过25±0.5℃、12 h光照条件下的PDA平板培养，从发病的龙柏鳞叶小枝的病健交界组织上共分离得到3种真菌，经鉴定，只有一株为植物病原真菌，标记为LB。LB菌株在PDA培养基上可形成圆形的灰褐色菌落，菌落边缘整齐，菌丝灰白色，棉絮状(图2，A)。病原菌形态特征的显微观察发现LB菌丝为有隔菌丝(图2，B)，分生孢子黄褐色，大小20.5～32.5μm×6.5～10μm，有纵横隔膜且分隔处明显缢缩(图2，C)，这些特征和真菌半知菌门的链格孢菌(Alternaria)[6]形态特征相符合。

图2LB菌株的菌落、菌丝孢子形态特征

Fig.2The characteristics of colony, hyphae and spore of LB

2.2.2病原菌的 rDNA-ITS序列特征分析及鉴定

真菌通用引物ITS1/ITS4对LB菌株基因组DNA扩增后得到的序列长度为578 bp，GenBank数据库同源性比较表明，LB与链格孢属(Alternaria)真菌的ITS序列具99 %以上的同源性。系统发育树分析表明， LB与链格孢Alternariaalternata(KJ002064.1)亲缘关系最近 (图3)。结合LB培养性状及形态学特征，拟鉴定龙柏叶枯病菌为链格孢Alternariaalternata。

图3　龙柏叶枯病菌LB的系统发育树

2.3　病害发生特点及影响因素

2.3.1发生特点

2012-2014年，通过对潍坊地区龙柏叶枯病发生情况观察记录，结果表明，龙柏叶枯病比其他常见植物病害发生早，一般在4月上旬(日均最高温度10℃左右)即可迅速发生、显症。龙柏叶枯病发生过程中会形成明显的发病中心(图1，D)，但向四周扩散蔓延的速度慢，说明其再侵染能力弱；在潍坊地区，当日平均最高温度超过30℃时，病害蔓延基本停止。

2.3.2影响因素

本研究对2012-2014年潍坊市区交通主干道东风街、胜利街和福寿街两旁的绿篱小龙柏和3个主要景观绿化区人民公园、白浪河湿地和植物园绿化色块小龙柏叶枯病发生情况调查结果表明，相同年份，东风街、胜利街和福寿街两旁的绿篱小龙柏上叶枯病的发病程度均高于人民公园、白浪河湿地和植物园的绿化色块小龙柏(图4)，这可能与行道绿篱小龙柏修剪频繁有关。

图4　2012-2014年潍坊市区主要园林绿化区

潍坊位于山东半岛中部，属于温暖带季风型半湿润气候，春季短促，干旱少雨，3-5月份的平均最高温度为19.5℃。在本研究调查的3个春季，2013年春季潍坊地区气温回升慢、冷凉天气持续时间长、降雨量充足，龙柏叶枯病的发生也相应最严重。这表明春季冷凉、多雨的气候条件会促进龙柏叶枯病的发生。

不同浇水、修剪处理下，龙柏叶枯病发病情况如图5所示。由图5可知，与不修剪处理相比较，龙柏叶枯病发生期修剪处理可显著提高病害的发生率(p=0.05)；定期修剪或者不修剪的条件下，喷灌浇水对病害的发生可起到一定的促进作用，但对病害的发生蔓延不会产生显著影响(p=0.05)。

图5　不同管理措施处理下龙柏叶枯病的发生情况

3结论与讨论

本研究表明，龙柏叶枯病以受害植株鳞叶小枝从上向下迅速干枯为典型症状，且病害春季发生早，发病中心明显，再侵染能力弱；春季冷凉多雨有利于病害的发生，病害发生期的养护修剪对病害传播具有促进作用，但浇水对病害蔓延影响不明显。因此，在冷凉天气持续时间长、降雨充足的春季，要警惕龙柏叶枯病的流行，及时采取预防性防治措施；病害发生初期及时拔除中心病株，病害蔓延过程中减少龙柏的修剪次数或尽量不修剪，可减轻龙柏叶枯病的发生。

植物病原真菌中的链格孢菌可引致桂花(OsmanthusfragransLour)[7]、银杏(GinkgobilobaL.)[8]等多种园林植物叶枯病。1992年，戴雨生等人[9]对侧柏〔Platycladusorientalis(L.) Franco〕叶枯病菌分离过程也分离到链格孢菌，但室内接种未获得成功，最后通过采集田间带子囊盘的病枝条做接种源获得了发病植株，于是鉴定侧柏叶枯病菌为子囊菌门、盘菌纲的绿胶杯菌(Chloroscyphaplatycladussp.Nov)。丁长年等人[10]也认为龙柏叶枯病菌为绿胶杯菌，病菌子囊盘在前一年夏、秋季节释放子囊孢子进行初侵染，经过冬季的潜伏侵染，翌春天气回暖后迅速显症。本研究在龙柏叶枯病的病原菌分离过程中，对具有典型叶枯病菌症状特点的龙柏鳞叶小枝经酒精消毒处理后，从病健交界处分离到了3种真菌菌株，经形态及ITS序列分析发现只有一菌株为植物致病菌链格孢菌，其余两种为内生毛壳菌(Cheatomium)，但是室内链格孢菌的致病性接种未获得成功。同时，在龙柏叶枯病寄主调查过程中，仅在极少数发病龙柏鳞叶小枝上发现了直径约3 mm左右的橘红色盘状物(图6，A)。显微观察发现，盘状物中密布子囊(图6，B)，子囊长棍棒状，内含有8个球形子囊孢子，子囊孢子无色、透明(图6，C)。综合上述文献报道及本研究结果，可以认为，龙柏叶枯病无性时期为链格孢菌，有性时期可能属于子囊菌，且以子囊孢子作为初侵染，在秋末侵染植株后潜伏越冬，第2年春季显症。因此，室内接种分离的链格孢菌难以获得发病植株。鉴于此，龙柏叶枯病菌及其侵染规律还有待于进一步研究。

图6龙柏鳞叶小枝上形成的子囊盘及子囊孢子形态

Fig.6The characteristics of ascocarp and ascus ofS.chinensisleaf blight

参考文献：

[1]卓丽环，陈龙请.园林树木学[M].北京:中国农业出版社，2003:90.

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[3]丁世民，张丽凤，宋健云，等.几种新传入园林病虫害在潍坊地区的发生概况与防治建议[J].潍坊高等职业教育，2011，7(1):68-72.

[4]方中达.植病研究方法[M].北京:中国农业出版社，1998:7-12.

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[6]陆家云.植物病原真菌学[M].北京:中国农业出版社，2000:392-398.

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[8]周志权，廖咏梅，黄炳金，等.银杏叶枯病病原菌侵染特性的研究[J].广西植保，2000，13(3):1-4.

[9]戴雨生，王学道，林其瑞.侧柏叶枯病病原菌研究[J].南京林业大学学报，1992，16(1):59-95.

[10]丁长年，吴祥春，蒋桂欣，等.龙柏模纹绿篱干枯原因及综合治理探析[J].中国园艺文摘，2014(7):90,120.

Isolation and Identification of Leaf Blight of Sabina chinensis cv.Kaizuka

LIU Cai-yun,XUE Jia-zhen,CHANG Zhi-long

(Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology，Biological and Agricultural College of Weifang University，

Weifang Shandong 261061，P.R.China)

Abstract:Leaf blight ofSabinachinensiscv.Kaizuka is a kind of new disease on landscape plants and its seedlings are vulnerable to the infection.The symptom and characteristics of the occurrence of the leaf blight ofS.chinensiscv.Kaizuka were studied by field experiments and surveys，and the isolated pathogen was identified based on the morphological characters and ITS sequence analysis.The results showed that the scale leaves withered from top to bottom was the typical symptom of the diseased plants，and the cool and rainy weather in spring and frequent pruning were the main causes of the leaf blight ofS.chinensiscv.Kaizuka.By morphological observation and ITS sequence analysis，the imperfect stage of the pathogen of Leaf blight ofS.chinensiscv.Kaizuka was identified asAlternariaalternate.The mycelium were isolated one with brown conidia of 20.5～32.5μm×6.5～10μm，crossbar diaphragm ,and its perfect stage was Ascomycete.

Key words:morphological characters; ITS sequence analysis; symptom; pathogen; occurrence characteristics；Alternariaalternate；Ascomycete

作者简介：第一刘彩云(1975-)，女，讲师，博士，主要从事植物病理学研究。E-mail:changyj2004@126.com

基金项目：潍坊学院博士基金项目(2012BS17)，山东省教育厅科技发展计划项目(J11LC62)，潍坊市科技发展计划项目(201301013)。

*收稿日期：2015-06-10

中图分类号：S 763

文献标识码：A

文章编号：1672-8246(2016)01-0037-05