张庆　茹庆国　林红梅　李辉　刘艳　吴清

摘要：目的 研究当归挥发油分子蒸馏后各馏分的化学组成及抗氧化能力。方法 用分子蒸馏设备对当归挥发油进行分馏，采用气相色谱-质谱法（GC-MS）表征各馏分的化学组成，采用主成分分析法（PCA）分析其化学组成的差异，用2，2-二苯基-1-苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力评价各馏分的抗氧化能力。结果 当归挥发油经分子蒸馏后得到6个馏分。GC-MS结果显示藁本内酯是各馏分的主要成分。PCA结果显示各馏分除了在Z-藁本内酯上的差异外，馏分6中的油酸和馏分5中的Z-氧代环十七碳-8-烯-2-酮与其他馏分有较大差异。抗氧化能力测定结果显示各馏分都有抗氧化能力但有差异，而且对馏分中藁本内酯的含量无依赖性，馏分6和馏分5的抗氧化能力较强，可能与其所含的特异性成分有关。结论 本研究可为当归和其他中药挥发油的进一步开发利用提供参考。

关键词：当归；挥发油；分子蒸馏；气相色谱-质谱法；抗氧化

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.023

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0082-06

GC-MS Analysis and Antioxidant Activity Study of Distillates Separated from Essential Oil of Angelicae Sinensis Radix by Molecular Distillation ZHANG Qing， RU Qing-guo， LIN Hong-mei， LI Hui， LIU Yan， WU Qing （Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

Abstract： Objective To study composition and antioxidant capacity of distillates separated from the essential oil of Angelicae Sinensis Radix by molecular distillation. Methods The distillates of the essential oil of Angelicae Sinensis Radix were obtained by molecular distillation equipment， and the composition of distillates was analyzed by GC-MS. The principal component analysis （PCA） was used to analyze the difference of the composition of each fraction. The DPPH free radical scavenging ability was applied to evaluate the antioxidant capacity of distillates. Results Six fractions were obtained by molecular distillation from the essential oil of Angelicae Sinensis Radix. GC-MS results showed that ligustilide was the main component in each fraction； PCA results showed that oleic acid in fraction 6 and Z-Oxacycloheptadec-8-en-2-one in infraction 5 were different from the other fractions； The antioxidant capacity results showed each fraction had antioxidant capacity， but they were different， and the capacity of antioxidant were uncorrelated with the content of ligustilide in distillates； antioxidant ability of fraction 6 and fraction 5 was strong， which may be related to specific components. Conclusion This study provided reference for further development of the volatile oil in Angelicae Sinensis Radix and other herbal medicine.

Key words： Angelicae Sinensis Radix； essential oil； molecular distillation； GC-MS； antioxidant

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根，有补血活血、调经止痛、润肠通便功效[1]，广泛应用于临床。现代药理研究表明，当归的有效成分有显著抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、神经保护、提高机体免疫力和抗肿瘤等作用。挥发油是当归的主要有效成分之一，有提高免疫力、消炎镇痛和抗血小板聚集等作用[2-3]。

超临界流体萃取法是一种快速、清洁的提取技术，提取过程中所需温度低，能保持挥发油成分的稳定，是中药挥发油常用的提取手段之一。分子蒸馏也称为短程蒸馏，是一种快速、高效、无污染的分离和浓缩技术，该技术被认为是分离和纯化天然产物的常用方法，尤适用于高沸点、高黏度且热敏性物质分离，被广泛用于中草药挥发油和其他精油的分离[4-5]。

中药挥发油成分复杂，来源广泛，有丰富的药理活性，如在心脑血管系统、中枢神经系统、呼吸系统、胃肠道系统、抗炎、抗肿瘤等方面均有良好作用，在医药方面应用前景广阔[6]。脂质过氧化与许多疾病有关，如癌症、心血管疾病等。2，2-二苯基-1-苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力在体外抗氧化实验中广泛应用于体外评价挥发油抗氧化活性[7-9]。

本研究采用超临界流体萃法取制备当归挥发油，使用分子蒸馏设备对所得挥发油进一步分馏，应用气相色谱-质谱法（GC-MS）对所得馏分的化学组成进行分析，并用主成分分析法（PCA）分析各馏分化学组成的差异性，采用DPPH自由基清除能力评价各馏分的抗氧化能力，为当归及其他中药挥发油的进一步开发利用提供依据。

1 仪器与试药

HA220-50-01超临界流体萃取仪（江苏南通华安超临界萃取有限公司），BSA224S分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），VLK-70分子蒸馏设备（德国瑞达有限公司），Thermo Finnigan 2000 Trace DSQ气相色谱-质谱仪（美国Thermo公司），Mutiskan GO多功能酶标仪（美国Thermo公司）。

当归饮片，购自北京本草方源药业有限公司，经北京中医药大学中药学院中药鉴定系刘春生教授鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根。将当归饮片粉碎成粗粉用于进一步的提取。DPPH、二甲基亚砜（DMSO），Sigma-Aldrich公司；色谱级乙酸乙酯，Fisher公司；无水乙醇、无水硫酸钠，北京化工厂。

2 方法

2.1 超临界流体萃取及分子蒸馏

根据本实验室前期确定的最佳提取工艺对当归进行超临界流体萃取[9]，以CO2为萃取溶剂。提取工作条件如下：工作压力30 MPa，工作温度50 ℃，提取时间2 h，CO2流量25 L/h；分离器Ⅰ的工作压力为8 MPa，温度50 ℃；分离器Ⅱ的压力为提取系统尾部的压力，工作温度35 ℃。

用分子蒸馏设备对所得挥发油进行分馏，工作条件如下：刮刀转速300 r/min，分子蒸馏过程真空度为0.35 mbar，滴速为1～2滴/s。通过改变温度来获得不同的馏分。将所得馏分保存在-20 ℃冰箱中用于进一步研究。

2.2 总提取物与各馏分分析

将各馏分适当稀释后，用无水硫酸钠脱水，然后采用GC-MS进行分析。采用安捷伦DB-5 MS柱（0.25 mm×30 m，0.25 ?m），进样口温度230 ℃；升温程序：80 ℃以3 ℃/min升温至167 ℃，保持2.5 min，以2 ℃/min升至202 ℃，以4 ℃/min升至280 ℃，保持15 min；载气为高纯氦气，流速为1 mL/min，进样量1 ?L，溶剂延迟4 min。离子源温度230 ℃，电离源为EI，电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；四级杆温度150 ℃，扫描质量范围为35～550 amu。

2.3 抗氧化能力测定

参考文献[10-12]方法，并稍作修改，测定DPPH自由基清除能力。精密称取DPPH粉末0.007 98 g放于1000 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，充分摇匀，得到浓度为200 μmol/L的DPPH储备液。将各馏分用DMSO溶解，分别稀释成相同的系列浓度梯度：100、80、60、40、20、10、5、1、0.5、0.1 mg/mL。分别取各浓度梯度的样品10 μL，加入到已盛放有90 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液的96孔板中，对照组加入等量的DMSO，空白组用等量无水乙醇代替DPPH溶液。25 ℃避光反应20 min后，于518 nm处测定反应混合物的吸光度，每个样品平行测定3次，计算DPPH清除率。DPPH清除率（%）=[1-（As-Aa）÷Ac]×100%。其中，As、Aa、Ac分别代表样品组、空白组（用DMSO代替样品溶液）和对照组（用乙醇代替DPPH溶液）的吸收度。

2.4 统计学方法

抗氧化试验结果采用SPSS20.0统计软件进行分析，数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。用Unscrambler 9.7进行主成分分析。

3 结果

3.1 当归挥发油及分子蒸馏各馏分

本研究用超临界流体萃取法制得了棕色澄明的当归挥发油，得率为1.4%，其中当归挥发油中藁本内酯的相对含量为65.98%。

当归挥发油进行分子蒸馏后得到6个不同的馏分，在100 ℃下分离得到了馏分1（F1），然后将残渣进一步分离，在110 ℃时，得到馏分2（F2），并将所得的残渣按照上述方法进一步分离，在120、130、140、150 ℃分别获得了馏分3（F3）、馏分4（F4）、馏分5（F5）、馏分6（F6）。从F1到F6的颜色逐渐加深，从浅黄色变化到橙黄色。

3.2 所得馏分的气相色谱-质谱分析

通过与NIST 2.0质谱图库提供的标准图谱进行比较，并查阅相关参考文献，确定各馏分中的化学成分。

GC-MS分析的6个馏分化学成分及相对含量见表1，采用面积归一化法确定馏分中各化学成分的相对含量。

藁本内酯是当归挥发油中的主要有效成分，GC-MS结果显示，藁本内酯仍是各馏分中含量最高的成分。各馏分中藁本内酯含量从低到高依次为：F6（32.77%）

3.3 主成分分析

为进一步研究各馏分中化学成分的差异性，采用Unscrambler软件中的PCA功能，对6个馏分中的化学成分进行分析，结果见图1、图2。

以6个馏分中所含化学成分的含量为变量进行分析，提取了2个主成分，图1、图2分别为得分图和载荷图，分别表示经过降维后6个馏分所含化学成分在二维空间的分布情况。从图1可以看出，主成分1解释了总变异的89%，主成分2解释了总变异的8%。F1、F2、F3、F4处于第一主成分轴的右边，在主因子1上得分较高，且F2与F4化学成分相似性最高；F6处于第二主成分轴的上边，在主成分2上得分较高。由图2可知，Z-藁本内酯在主因子1上载荷最大，说明6个馏分Z-藁本内酯的含量差异最大；F6与其他馏分差异性较大，第二主成分主要与油酸有关，说明油酸可以作为F6的特征性成分。另外，（Z）-氧代环十七碳-8-烯-2-酮对F5的差异性影响较大，可作为F5的特征性成分。而其他化学成分重叠的较多，说明它们的相似性较高。馏分中有特征性成分的存在，可能会影响其抗氧化能力。

3.4 各馏分DPPH自由基清除能力

所有馏分均有DPPH自由基清除能力，且具有剂量依赖性，随着剂量增大而提高，各馏分的DPPH自由基清除率曲线见图3。用半数有效量（EC50，反应20 min后清除50%DPPH自由基所需的样品浓度）评价各馏分自由基清除能力的强弱，见表2。DPPH自由基清除能力强弱依次为：F6>F5>F4>F1>F3>F2。结合各馏分中藁本内酯含量可知，藁本内酯不是决定各馏分抗氧化能力的唯一因素。

4 讨论

本研究GC-MS结果显示各成分具有一定的相似性，主要成分藁本内酯含量有明显差异，随着蒸馏的进行，各馏分中藁本内酯含量呈现先增后减的趋势。

本研究采用DPPH自由基清除能力评价各馏分的抗氧化能力。结果显示，各馏分均有抗氧化能力，其抗氧化能力有剂量依赖性。结合各馏分中藁本内酯的含量分析，F6藁本内酯含量最低而抗氧化能力最强，相反，F2藁本内酯含量相对较高，其抗氧化能力却相对较弱，这表明各馏分中藁本内酯的共存成分对馏分的抗氧化能力发挥了重要的作用。结合PCA分析结果，F6中的油酸、F5中的（Z）-氧代环十七碳-8-烯- 2-酮是各自的特有成分，且F6和F5的抗氧化能力都较强，说明各馏分中与藁本内酯共存的化学成分可能起到了协同抗氧化作用。因此，本研究可为当归及其他中草药挥发油的进一步研究开发和利用提供有价值的资料。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：124-125.

[2] 刘医辉，杨世英，马伟林，等.当归药理作用的研究进展[J].中国当代医药，2014，21（22）：192-193，196.

[3] 李曦，张丽宏，王晓晓，等.当归化学成分及药理作用研究进展[J].中药材，2013，36（6）：1023-1028.

[4] 李燕，刘军海.分子蒸馏技术在天然产物分离纯化中应用进展[J].粮食与油脂，2011（3）：7-11.

[5] 徐浩锋，杨华俊，俞岚.中药有效成分现代提取技术研究进展[J].海峡药学，2012，24（1）：13-18.

[6] 黄罗生，顾燕飞，李红.中药挥发油及芳香性药物的研究进展[J].中国中药杂志，2009，34（12）：1605-1611.

[7] ARORA N， PANDEY-RAI S. GC-MS analysis of the essential oil of Celastrus paniculatus Willd. seeds and antioxidant， anti- inflammatory study of its various solvent extracts[J]. Industrial Crops and Products，2014，61：345-351.

[8] 赵晨，李蓉，邹国林.桂丁、花椒挥发油抗氧化活性及其方法研究[J].武汉大学学报（理学版），2008，54（4）：447-450.

[9] 赵晨.植物挥发油抗氧化活性的研究[J].中国调味品，2008，33（11）：40-43.

[10] 姜玉兰，朴惠善，李镐.桑叶抗氧化活性成分的研究[J].中药材， 2008，31（4）：519-522.

[11] 陈智坤，梁呈元，李维林，等.薄荷不同溶剂提取物抗氧化活性的研究[J].食品工业科技，2013，34（3）：100-103.

[12] 付晓丹，汤春丰，刘壤莲，等.枇杷叶黄酮提取物的抗氧化作用研究[J].食品工业科技，2015，30（1）：135-139.

（收稿日期：2015-06-11）

（修回日期：2015-06-24；编辑：陈静）