刘　然，张惠子，云皓琪，陈　阳，2，黄正洋，2，张　扬，2，徐　琪，2，陈国宏，2*

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，扬州 225009； 2.江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，扬州 225009)



miRNA-34基因家族进化分析及其在鹅生殖周期内的表达变化

刘然1，2#，张惠子1#，云皓琪1，陈阳1，2，黄正洋1，2，张扬1，2，徐琪1，2，陈国宏1，2*

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，扬州 225009； 2.江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，扬州 225009)

摘要：旨在探明miRNA-34基因家族(miRNA-34s)系统进化历程及其在鹅生殖周期内的表达变化规律。通过文献和miRBase数据库检索脊椎动物的miRNA-34s序列，利用Ensembl数据库信息，确定miRNA-34s在基因组中的位置，采用MEGA 6.0构建miRNA-34s的系统进化树；并利用RT-qPCR检测鹅卵巢组织miRNA-34s在生殖周期内的表达变化。结果在脊椎动物中共搜索70余条miRNA-34s序列，miRNA-34s 3个成员(miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)在脊椎动物中分布广泛，高度保守，均位于基因间隔区(Intergenic region，IGR )，且miRNA-34b和miRNA-34c两个基因位于同一染色体上，在进化过程中紧密相连，可能是由于串联重复所致。RT-qPCR检测结果显示，miRNA-34s 3个成员在鹅的开产前期、排卵期、排卵后期和就巢期卵巢组织中表现出相同趋势的表达，即在排卵期、排卵后期表达水平高于或显著高于开产前期和就巢期。miRNA-34家族在进化中高度保守，且在调控鹅生殖周期中发挥一定的作用。

关键词：鹅；miRNA-34；进化；定量表达

microRNA(miRNA)作为广泛影响基因表达的潜在调控因子，在真核细胞中具有高度的保守性。miRNA在细胞生长、维持内环境稳定及病理过程中起重要作用。miRNA主要通过结合目的mRNA的3′非编码区域的互补序列来发挥作用，并通过加速转录的进程来抑制基因表达，或通过与多蛋白RISC的相互作用来抑制翻译进程[1]。不同物种间的同源miRNA存在高度进化保守性，如miRNA-l、miRNA-34、miRNA-87在无脊椎动物和脊椎动物中高度保守，序列比对分析发现这些保守序列的碱基差异仅为1～2 nt[2]。miRNA在物种间的保守性使其成为探索非编码RNA进化规律的理想分子。

miRNA-34家族包括3种miRNA(a/b/c)，它们包含相同的种子区域，具有高度保守性。这种保守性与其功能有着密切关系。研究显示，miRNA-34家族成员在配子形成和早期胚胎发育过程中发挥重要的作用[3-5]。A.Tscherner等[6]研究发现miRNA-34s主要作用于牛配子形成时期，且在精子中miRNA-34s有独特的表达特征，可以作为雄性的生产力指标。有研究发现miRNA-34a和miRNA-34b在多种组织中广泛表达[7-8]，但miRNA-34c仅在生殖腺等组织中检测到[9]。王勃[10]通过RT-qPCR技术比较miRNA-34c在牛胎儿成纤维细胞、精子、MII期卵母细胞中表达，确定miRNA-34c在精子中表达量较高，而在体细胞、卵母细胞中的相对表达量非常低。精子中所携载的miRNA-34c可以通过诱导表达的形式赋予供体细胞，能提高胚胎发育能力、核重编程及胚胎质量。精子miRNA-34c表达水平可能会影响卵裂期的胚胎质量，对卵裂期的胚胎发育起到一定的积极作用[11]。本课题组前期以浙东白鹅为研究对象，采用Solexa深度测序产蛋和就巢组鹅卵巢miRNA的转录组，用生物信息学来确定miRNA的差异表达。鉴定1 328条已知的保守miRNA和22个新的潜在候选miRNA，发现miRNA-34家族在产蛋鹅和就巢鹅之间表达差异达到显著水平[12]。综上表明，miRNA-34家族与生殖调控关系密切，且与配子生成有关。

鉴于miRNA-34s与生殖调控及配子生成密切相关，在前期研究的基础上，为进一步探明miRNA-34s进化分析及其在鹅生殖周期内的表达变化，本研究利用Ensembl数据库信息，比对几种常见禽类miRNA-34s前体序列，确定miRNA-34s在基因组中的位置，构建miRNA-34s系统进化树；并利用RT-qPCR检测鹅卵巢组织miRNA-34s的表达变化，旨在为进一步揭示鹅miRNA-34s在生殖调控中作用奠定基础。

1材料与方法

1.1miRNA-34序列的获得

从miRBase(http：//www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl) 中下载获得25种脊椎动物的miRNA-34基因成熟序列及前体序列，并从已报道文献中获得鸭和鹅的miRNA-34基因成熟序列[12-13]，其前体序列从鸭、鹅genome assembly scaffolds BLAST获得。

1.2几种常见禽类的miRNA-34s基因定位

采用Ensembl数据库BLAST(http：//asia.ensembl.org/index.html)程序，分别用家鸡、家鸭、家鹅、斑胸草雀等4个禽类(以人、小鼠)的miRNA-34前体序列对其基因组数据库进行搜索，以确定miRNA-34s在基因组中的位置。

1.3miRNA-34s系统发生分析

选择21种脊椎动物和无脊椎动物中每个种属中代表性物种，采用Clustal W软件对其miRNA-34基因的前体序列进行多序列比对分析(Multiple sequences alignment，MSA)，利用MEGA 6.0软件采用基于距离参数的邻接法(Neighbor-joining，NJ)，并自展分析(Bootstrap) 1 000次，构建miRNA-34s的系统进化树。

1.4miRNA-34s在鹅生殖周期内的定量表达检测

鹅的生殖周期分段明显，包含产蛋前期、产蛋期(就巢期)和休产期等几个阶段。鹅150日龄开产，产蛋一段时间后，体温升高，被毛蓬松，抱蛋而窝，停止产蛋即进入就巢期。本试验采用miRcute miRNA Isolation Kit (TIANGEN，China，DP501)分别提取开产前期(120日龄)、产蛋期(380日龄，排卵前)、产蛋期(380日龄，排卵后)和就巢期(380日龄)浙东白鹅母鹅卵巢基质的sRNA，取3 μL sRNA，采用Poly(A)加尾法进行RT-PCR，具体操作按miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis kit (Tiangen)试剂盒说明书进行。采用SYBR Green qPCR 法检测miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c的表达量，扩增引物见表1，PCR扩增采用两步法，PCR反应条件参照miRcute miRNA qPCR detection kit试剂盒说明书进行，PCR反应在Applied Biosystems 7500 荧光定量 PCR系统中进行，U6作为内参，每个样本重复3次，采用2-ΔΔCt计算miRNA相对表达量(以开产前期卵巢组织为对照)。各时期表达量差异采用独立样本t检验(Independent-samplesttest)进行统计分析。

表1miRNA-34s RT-qPCR扩增引物

Table 1Sequence of the oligonucleotide primers of RT-qPCR

2结果

2.1miRNA-34s及其在基因组中的定位

根据文献[12-14]和miRBase检索共搜索27种脊椎动物70余条miRNA-34s序列，其中人类(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)和鸡(Gallusgallus)等18种脊椎动物都具有miRNA-34s 3个成员(miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)；绒毛猴(Lagothrixlagotricha)、蜘蛛猴(Atelesgeoffroyi)和平顶猴(Macacanemestrina)仅检索到miRNA-34a；树鼩(Tupaiachinensis)和热带爪蟾(Xenopustropicalis)拥有miRNA-34a和miRNA-34b，且发现热带爪蟾存在xtr-miRNA-34b、xtr-miRNA-34b-1、xtr-miRNA-34b-2、xtr-miRNA-34b-3和xtr-miRNA-34b-4 同源序列；鸭嘴兽(Ornithorhynchusanatinus)和猪(Susscrofa)拥有miRNA-34a和miRNA-34c。

以家鸡、家鸭、家鹅、斑胸草雀4个禽类(以人、小鼠)的miRNA-34前体作为查询序列(Query sequence)，分别对其相关基因组进行BLAST 搜索，确定各序列在基因组中的位置(表2)，基因定位显示，与其它哺乳动物miRNA主要定位在内含子区域不同的是，禽类miRNA-34s家族3个成员均位于基因间隔区(Intergenic region，IGR )，且miRNA-34a和miRNA-34b两个基因位于同一染色体上。

2.2miRNA-34s序列分析

对14种典型物种的miRNA-34s的成熟序列进行多序列比对分析(图1)，结果显示，miRNA-34s的成熟序列同源性很高，序列长度(22～23 nt)相近，保守碱基17个，分别为第3～10位、14～20位以及22～24位碱基，说明miRNA-34s在不同物种间的高度保守性。比对结果显示，miRNA-34s在其进化过程中可能发生了缺失，有的物种在第1位、25位和26位缺失了碱基U/C，大多数物种在第13位缺失了碱基A/G；在第12和21位碱基分别出现A>C和A>G。

2.3miRNA-34s系统进化树的构建

来源于miRBase中miRNA-34基因主要分布在脊椎动物哺乳纲、鸟纲、两栖纲以及无脊椎动物的昆虫纲和线虫纲等，采用MEGA 6.0软件，以这些纲目中的代表性物种miRNA-34s序列构建基于距离参数的邻接法系统发育进化树(图2)。由图2可以看出，进化树大致可分为两支：miRNA-34b和 miRNA-34c位于第一分支中，这一分支中只有一个例外是spu-miRNA-34，另一分支为 miRNA-34/miRNA-34a。从进化树的分支和距离上看，miRNA-34a基因的分支出现在进化早期，并且一直延续到现在，因而它很可能是miRNA-34 基因家族中最早出现的基因形式，即祖先基因。在无脊椎动物中，miRNA-34 基因只有一个拷贝(miRNA-34)，而在脊椎动物中 miRNA-34 基因一般都有3种形式 (miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)，且miRNA-34基因家族的3个成员稳定地存在于从鱼类到哺乳动物中。

2.4miRNA-34s在鹅生殖周期内的定量表达检测

采用RT-qPCR对开产前期、产蛋期(排卵)、产蛋期(排卵后)和就巢期鹅卵巢基质miRNA-34家族成员进行检测，结果见图3。由图3可以看出，miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c在鹅卵巢组织中均有表达，且开产前期、排卵期、排卵后期和就巢期呈现一定规律表达，即在排卵期、排卵后期表达水平高于或显著高于开产前期和就巢期。

表2miR-34s在基因组中的定位

Table 2Genomic location of miR-34 gene family

3讨论

microRNA作为重要的内源性调控基因，分布范围广，参与多种生物学调控过程[15]。miRNA-34s在脊椎动物中分布广泛，且高度保守，但在无脊椎动物和脊椎动物中miRNA-34s成员数并不相同，在漫长的进化过程中，3个成员组成的miRNA-34 基因家族保守地存在于几乎所有的脊椎动物中，这是否意味着与无脊椎动物相比，脊椎动物需要更多的miRNA-34 基因来形成一个基因调控网络，从而成功的行使其调控功能。对miRNA-34s的进化分析显示，miRNA-34a基因主要出现在进化早期，为祖先基因，且miRNA-34b和mir-34c基因亲缘关系很近，且位于同一染色体上聚集成簇，暗示它们在进化过程中紧密相连，这可能在miRNA-34基因进化过程中出现了串联重复所致。J.Hertel等[16]在后生动物基因组miRNA基因家族之间的系统发育分析，揭示了串联重复和片段重复是miRNA基因簇进化的主要机制，也因此产生miRNA基因簇和miRNA基因家族的多样性分布。作为转录后水平调控元件，miRNA成熟序列5′端 的第2～8位碱基对于其功能的正常发挥至关重要，被称为种子序列(Seed sequence)[2]。Blast结果显示，不同物种的miRNA-34s种子序列保守性为100%，暗示其功能的保守性。本研究中也发现miRNA-34s成员在鹅的开产前期、排卵期、排卵后期和就巢期表现出相同趋势的表达。miRNA-34家族成员在不同生殖时期的表达变化较大。这提示miRNA-34家族在调控鹅生殖周期中发挥重要作用。有报道miRNA-34家族的成员 (miRNA-34a/b/c)是p53作用的直接靶点[15]。miRNA-34s在小鼠睾丸等组织的高表达在很大程度上依赖p53在这些组织中的表达，并在p53通路中的存在其他作用。在鹅的生殖周期调控中，受生殖激素水平的制约，如孕酮(P4)，开产前P4慢慢上升，并在产蛋高峰期维持高水平，就巢期最低，且排卵周期内P4在产蛋前13 h内分别出现两次高峰[17]。这一结果与本研究miRNA-34s在在不同生殖时期的表达变化规律一致。孕酮能上调卵巢细胞的p53表达[18]；笔者推测miRNA-34家族成员在不同生殖时期的表达变化仍依赖p53表达。

4结论

4.1miRNA-34家族3个成员(miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)在脊椎动物中分布广泛，且高度保守；均位于基因间隔区(Intergenic region，IGR )，且miRNA-34b和miRNA-34c两个基因位于同一染色体上，在进化过程中紧密相连，可能是由于串联重复所致。

4.2RT-qPCR检测结果显示，miRNA-34s成员(miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)在鹅的开产前期、排卵期、排卵后期和就巢期卵巢组织中表现出相同趋势的表达，即在排卵期、排卵后期表达水平高于或显著高于开产前期和就巢期。

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(编辑程金华)

Molecular Evolution Analyzing of miRNA-34 Gene Family and Its Expression in Goose Reprodutive Cycle

LIU Ran1，2#，ZHANG Hui-zi1#，YUN Hao-qi1，CHEN Yang1，2，HUANG Zheng-yang1，2，ZHANG Yang1，2，XU Qi1，2，CHEN Guo-hong1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.JiangsuKeyLaboratoryofAnimalGenetics&BreedingandMolecularDesign，Yangzhou225009，China)

Key words:goose；miRNA-34；evolution；quantitative expression

Abstract:This experiment was conducted to investigate the miRNA-34 gene family evolutionary process and its expression regularity in goose reproductive cycle.The miRNA-34 genes were searched in literatures and miRBase.It’s genes were located by Ensemble database，and its phylogenetic tree was constructed by MEGA 6.0.In addition，the expression level of miRNA-34s was detected in ovarian tissue of goose reproductive cycle using RT-qPCR.A total 70 sequences in 27 species which indicated the extensive existence of miRNA-34s(miRNA-34a，miRNA-34b and miRNA-34c) in different species.The analysis of gene localization showed all miRNA-34 genes were located on the intergenic region(IGR).miRNA-34b and miRNA-34c shared on the same chromosome and they were closely linked in evolutionary process，which maybe caused by tandem repeats.Besides，the similar expression of miRNA-34s were detected in goose ovary tissues of pre-laying stage，ovulation，oviposition，and the broody phase.More miRNA-34s expression was detected at ovulation，oviposition than that in pre-laying and broody phase period.The miRNA-34s are highly conservative in evolution process，and play a role in regulation reproductive activity in goose.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.007

收稿日期：2015-06-10

基金项目：江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目(201411117050Y)；现代农业产业技术体系建设专项CARS-43-3)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(苏政办发[2011]137号)

作者简介：刘然(1990-)，女，山东济宁人，硕士生，主要从事动物遗传育种与繁殖方面研究，E-mail:betterlr@163.com；张惠子(1993-)，女，江苏连云港人，本科生，主要从事动物科学研究，E-mail：15396752381@163.com。刘然和张惠子为并列第1作者 *通信作者：陈国宏，E-mail：ghchen@yzu.edu.cn

中图分类号：S835.2

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0260-08