黄志盛　何海萍　梁锐彬

【摘要】 目的 探讨载体介导短发夹核糖核酸（shRNA）对胃癌细胞株MKN45中原癌基因C-met的抑制作用。方法 9株胃癌细胞株分为转染组、阴性对照组和空白对照组， 各3侏。通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术， 观察转染24 h和48 h后， 原癌基因C-met的信使核糖核酸（mRNA）的CT值的变化；通过免疫印迹试验（Western blot）， 观察转染后C-met的蛋白变化；通过四氮唑盐MTT比色法， 计算细胞存活率。结果 载体介导的C-met shRNA转染24 h和48 h后， RT-PCR结果显示， C-met的mRNA抑制率分别为56%和88%；与空白对照组比较， C-met的蛋白表达水平明显下降， 转染后24 h [（0.812±0.105） VS （0.640±0.011）]、48 h[（0.811±0.103） VS （0.331±0.009）]， 差异均有统计学意义（P<0.05）；MTT比色法显示， 细胞存活率均有明显下降， 转染后24 h为65.9%， 48 h为59.6%。结论 载体介导的C-met shRNA不仅可降低胃癌细胞株MKN45中原癌基因C-met的mRNA及其蛋白表达水平， 而且对癌细胞的存活有明显的抑制作用。

【关键词】 载体介导；胃癌；信使核糖核酸；原癌基因C-met

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.05.015

Inhibiting effect by vector-mediated shRNA on C-met in stomach cancer cell strain MKN45 HUANG Zhi-sheng， HE Hai-ping， LIANG Rui-bin. Department of Gastroenterology， Guangzhou City Panyu District Shawan Peoples Hosptal， Guangzhou 511400， China

【Abstract】 Objective To investigate inhibiting effect by vector-mediated short hairpin RNA （shRNA） on proto-oncogene C-met in stomach cancer cell strain MKN45. Methods A total of 9 stomach cancer cell strains were divided into transfection group， negative control group and blank control group， with 3 strains in each group. Real-time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was applied to observe changes of CT value of messenger ribonucleic acid （mRNA） in proto-oncogene C-met after 24 and 48 h of transfection. Western blot was used to observe changes of protein in C-met after transfection. Tetrazolium-based colorimetric assay （MTT） was applied to calculate cell survival rate. Results In 24 and 48 h after vector-mediated mRNA shRNA transfection， RT-PCR showed mRNA inhibition rates by C-met were respectively 56% and 88%. Comparing with the blank control group， C-met had obviously reduce protein expression level， as [（0.812±0.105） VS （0.640±0.011）] in 24 h after transfection and [（0.811±0.103） VS （0.331±0.009）] in 48 h after transfection. Their differences all had statistical significance （P<0.05）， MTT showed obviously decreased cell survival rate， as 65.9% in 24 h after transfection and 59.6% in 48 h after transfection. Conclusion Vector-mediated C-met shRNA can not only reduce mRNA and its protein expression in proto-oncogene C-met of stomach cancer cell strain MKN45， and also show remarkable inhibiting effect for survival of cancer cell.

【Key words】 Vector-mediated； Stomach cancer； Messenger ribonucleic acid； Proto-oncogene C-met

据Roder[1]报道， 我国为胃癌的高发地区。有研究发现[2]， RNA干扰是人为引入与内源靶基因具有相同序列双链RNA， 诱导内源靶基因的mRNA降解， 达到阻止基因表达的目的。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 胃癌细胞株MKN45购自上海市消化疾病研究所（共9株）；实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒购自美国Promega公司；小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）一抗、小鼠抗人C-met一抗、辣根过氧化物物酶标记兔抗小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司； C-met shRNA和阴性对照购自美国OPEN-BIOSYSTEMS公司。

1. 2 方法 实验分组：转染组（转染shRNA）、阴性对照组（转染错义序列）和空白对照组（未转染shRNA）， 各3株。细胞转染， RT-PCR检测各组的C-met的 mRNA表达， 读取每孔的CT值[3， 4]， 计算各分组目的基因相对定量值。Western blot法检测C-met的蛋白表达：收集各分组细胞， 加入稀释过的抗体（小鼠抗人β-actin一抗1∶150、小鼠抗人C-met一抗1：150）4℃孵育过夜， 漂洗后加入辣根过氧化物物酶标记兔抗小鼠二抗， 化学发光法显色， 用目的蛋白C-met A值与内参β-actin A值的比值分析[5]。……