王旭，黄舒柠，雷玲

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

抗IL-17A单克隆抗体对系统性硬化病小鼠纤维化病变的抑制作用及其机制

王旭，黄舒柠，雷玲

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

目的 观察抗白介素17A(IL-17A)单克隆抗体对系统性硬化病(SSc)小鼠纤维化病变的影响，并探讨其相关机制。方法将24只小鼠随机分为正常对照组、模型组、抗体组、同型对照组，每组6只。模型组于背部中央区域皮下注射博来霉素(BLM)，抗体组注射BLM+抗IL-17A单克隆抗体，同型对照组注射BLM+同型对照抗体，正常对照组注射磷酸盐缓冲液，共3周。取其皮肤和肺组织，观察病理变化；测量皮肤厚度，进行皮肤炎症评分和肺炎症、纤维化评分；采用实时荧光定量PCR法检测皮肤和肺组织IL-17A、转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)mRNA相对表达量。结果正常对照组皮肤无明显炎症细胞浸润及胶原增生，肺泡结构正常。模型组真皮层和肺泡间隔明显增厚，皮肤胶原明显增生；肺间质内有大量炎症细胞浸润，纤维组织增生，可见胶原束形成。同型对照组皮肤和肺组织病理改变与模型组相似。抗体组皮肤增厚，皮肤和肺组织炎症细胞浸润，肺纤维组织增生，但程度均轻于模型组和同型对照组。与正常对照组比较，模型组、抗体组、同型对照组皮肤厚度和炎症评分、肺炎症和纤维化评分均升高，皮肤和肺组织IL-17A、TGF-β1、CollagenⅠ mRNA相对表达量均升高，但模型组和同型对照组均高于抗体组(P<0.05或<0.01)。模型组和同型对照组上述指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论抗IL-17A单克隆抗体可抑制SSc小鼠的皮肤和肺纤维化病变；减少TGF-β1和CollagenⅠ生成可能是其作用机制。

系统性硬化病；抗白介素17A单克隆抗体；转化生长因子β1；Ⅰ型胶原；肺纤维化；小鼠

系统性硬化病(SSc)是一种以组织纤维化，血管病变及免疫调节异常为主要特点的慢性结缔组织

疾病，发病率为(50～300)/100万[1]。SSc的发病机制尚不明确，普遍认为可能与血管病变、免疫系统激活等有关，目前临床上尚无逆转纤维化的有效措施。免疫细胞特别是T淋巴细胞在SSc发病中发挥重要作用，Th17细胞为近年发现的一种辅助性T细胞，白介素17A(IL-17A)为其主要的效应因子，具有促炎作用。多项研究显示，SSc患者Th17细胞比例和IL-17A表达升高，IL-17A能够促进SSc小鼠皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成，并参与SSc的免疫炎症反应及纤维化病变[2～5]。但目前关于IL-17A是否具有促纤维化作用尚存有一定争议[3，6]。为此我们于2015年1～6月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：雌性BALB/c小鼠24只，SPF级，6～8周龄，体质量18～20 g，由广西医科大学实验动物中心提供。试剂及仪器：注射用博来霉素(BLM，15 mg/支)购于日本化药株式会社；小鼠抗IL-17A单克隆抗体、同型对照兔IgG2a均购于美国R&D公司；TRIzol试剂、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂及引物均购于日本TaKaRa公司。

1.2 模型制备及分组处理 将24只小鼠随机分为正常对照组、模型组、抗体组、同型对照组，每组6只。各组均采用10%硫化钠溶液脱去小鼠背部中央区域毛发(面积约1.5 cm×1.5 cm)，模型组、抗体组、同型对照组均参照文献[5]建立SSc模型：以4.5无菌注射针头于小鼠背部中央区皮下注射1 g/mL BLM溶液0.1 mL，1次/d，连续3周。抗体组、同型对照组分别于建模第4、10、16天腹腔注射抗IL-17A单克隆抗体0.1 mL(200 μg/只)、同型对照兔IgG2a 0.1 mL(200 μg/只)。正常对照组于背部中央区皮下注射磷酸盐缓冲液0.1 mL，1次/d，连续3周。

1.3 标本采集 皮肤标本：各组处理3周后处死小鼠，剪下背部无毛皮肤，分为两份。一份置于10%中性甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋，4 μm厚度连续切片；另一份于-80 ℃保存待测。肺组织标本：打开小鼠胸腔，取出右肺后参照上法制成石蜡标本，4 μm厚度连续切片；取出左肺迅速移至-80 ℃冰箱保存。

1.4 相关指标观察

1.4.1 皮肤和肺组织病理变化 取1.3中制备的皮肤及肺组织石蜡切片，分别进行HE染色(观察皮肤和肺部的炎症)及Masson染色(观察皮肤和肺部的胶原沉积)。HE染色：切片脱蜡至水，苏木素浸染，1%盐酸乙醇分化，0.5%伊红溶液复染，脱水透明封片。Masson染色：切片脱蜡至水，苏木素染5～10 min，1%盐酸乙醇分化，流水冲洗数分钟；丽春红酸性品红染液染5～10 min，流水稍冲洗；1%磷钼酸溶液处理5 min，亮绿液复染5 min，1%冰醋酸处理1 min，脱水透明封片。将HE染色及Masson染色后的切片分别置于40、200倍光镜下，观察皮肤和肺组织病理变化。

1.4.2 皮肤厚度及炎症评分 取1.4.1中经HE染色后的皮肤组织切片，采用病理图像分析仪系统软件测量皮肤厚度。参照Yamamoto等[7]的方法对皮肤炎症情况进行半定量评分，没有炎症为0分、少许炎症为1分、轻度炎症为2分、中度炎症为3分、重度炎症为4分。由2位病理科医生采取盲法进行阅片。

1.4.3 肺炎症及纤维化评分 取1.4.1中经HE染色后的肺组织切片，参照Serena等[8]的方法行肺组织炎症评分，计数每个视野中肺间质、血管旁及支气管旁区域的白细胞数，其中散落的白细胞为0分、<15个为1分、15～50个为2分、>50个为3分。取1.4.1中经Masson染色后的肺组织切片,随机选择切片区域，于200倍光镜下按照Ashcroft半定量评分[9]评价其纤维化情况，总分为8分，正常肺组织为0分，全部区域纤维性闭塞为8分。由2位病理科医生采取盲法进行阅片。

1.4.4 皮肤和肺组织IL-17A、转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)mRNA相对表达量 采用实时荧光定量PCR法。取冻存的小鼠左肺组织、皮肤组织各100 mg，TRIzol试剂提取总RNA，按照逆转录盒操作说明，将总RNA逆转录为cDNA。采用SYBR绿色核酸染料进行荧光定量PCR检测，以β-actin为内参物。IL-17A：上游引物：5′-GGAAAGCTGGACCACCACA-3′，下游引物：5′-CACACCCACCAGCATCTTCTC-3′；反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、31 s，40个循环。TGF-β1：上游引物：5′-GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTA-3′，下游引物：5′-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3′；反应条件：94 ℃、3 min，94 ℃、20 s，54℃、30 s，72 ℃、31 s，40个循环。CollagenⅠ：上游引物：5′-GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC-3′，下游引物：5′-GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA-3′；反应条件：94 ℃、3 min，94 ℃、18 s， 58 ℃、30 s，72 ℃、31 s，40个循环。β-actin：上游引物：5′-ATCCACGAAACTACCTTCAA-3′，下游引物：5′-ATCCACACGGAGTACTTGC-3′；反应条件：94 ℃、3 min，94 ℃、20 s，57.5 ℃、30 s，72 ℃、31 s，40个循环。各样本均设3个复孔，以2-ΔΔCT法计算皮肤和肺组织IL-17A、TGF-β1、CollagenⅠ mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 皮肤和肺组织病理变化 皮肤组织切片HE染色及Masson染色显示，正常对照组无明显炎症细胞浸润及胶原增生。模型组真皮层明显增厚，附属器萎缩，可见炎症细胞浸润，胶原明显增生。同型对照组皮肤相关病理改变与模型组相似。抗体组可见皮肤增厚及炎症细胞浸润，但程度轻于模型组和同型对照组。肺组织切片HE染色和Masson染色显示，正常对照组肺泡结构正常，无明显炎症及纤维化改变。模型组肺泡间隔增厚，肺间质内有大量炎症细胞浸润，肺泡结构被破坏，纤维组织增生，可见胶原束形成。同型对照组肺组织病理改变与模型组相似。抗体组可见炎症细胞及纤维组织增生，但轻于模型组和同型对照组，部分肺泡结构尚存在。

2.2 皮肤厚度及炎症评分 与正常对照组比较，模型组、抗体组和同型对照组皮肤厚度和炎症评分均升高，但模型组和同型对照组均高于抗体组(P均<0.01)。模型组和同型对照组皮肤厚度和炎症评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组皮肤厚度及炎症评分比较

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01；与抗体组比较，△P<0.01。

2.3 肺炎症及纤维化评分 与正常对照组比较，模型组、抗体组和同型对照组肺炎症及纤维化评分均升高，但模型组和同型对照组均高于抗体组(P均<0.01)。模型组和同型对照组肺炎症及纤维化评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组肺炎症及纤维化评分比较(分

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01；与抗体组比较，△P<0.01。

2.4 皮肤和肺组织IL-17A、TGF-β1、CollagenⅠ mRNA相对表达量 与正常对照组比较，模型组、抗体组、同型对照组皮肤和肺组织IL-17A、TGF-β1、CollagenⅠ mRNA相对表达量均升高，但模型组和同型对照组均高于抗体组(P<0.05或<0.01)。模型组、同型对照组皮肤和肺组织IL-17A、TGF-β1、CollagenⅠ mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3、4。

表3 各组皮肤组织IL-17A、TGF-β1、CollagenⅠ mRNA相对表达量比较

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01；与抗体组比较，▲P<0.05，○P<0.01。

表4 各组肺组织IL-17A、TGF-β1、CollagenⅠ mRNA相对表达量比较

注：与正常对照组比较，*P<0.01，▲P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与抗体组比较，△P<0.05。

3 讨论

SSc是一种以炎症反应、血管病变、皮肤及内脏纤维化为主要病理特点的疾病，其中炎症反应及血管病变为早期SSc的主要病理改变，纤维化为晚期SSc的主要病理改变。SSc早期组织纤维化成分主要为弹性纤维，后期主要为CollagenⅠ。BLM诱导的SSc小鼠模型能够很好地反映皮肤及肺组织炎症、纤维化等病理改变，为目前应用最广泛的SSc建模方法[10]。本研究结果显示，与正常对照组比较，模型组皮肤增厚、肺组织结构破坏，皮肤和肺组织可见胶原纤维沉积及炎症细胞浸润，呈现出典型的SSc纤维化及炎症病理改变。

IL-17A主要有促炎作用，促纤维化作用尚未完全明确。国外研究发现，SSc小鼠皮肤IL-17A表达升高，与皮肤的炎症及纤维化程度呈正相关；IL-17A能够增加SSc小鼠皮肤成纤维细胞中TGF-β1、结缔组织生长因子(CTGF)等促纤维化因子的表达及胶原合成[2]。肺间质纤维化是SSc的主要并发症，也是其主要的致死原因。既往研究发现，SSc小鼠肺组织IL-17A表达明显升高，与肺组织炎症、纤维化程度呈正相关[2]。SSc患者IL-17A表达亦升高，与高分辨率CT评分呈正比[11]。上述研究提示，IL-17A可能参与SSc炎症及纤维化病变的发生和发展。国外学者发现，在BLM诱导的小鼠SSc模型中，IL-17A基因敲除小鼠的皮肤及肺组织纤维化程度明显轻于野生型小鼠[12]。Mi等[13]发现多个肺纤维化动物模型中IL-17A表达均升高，而降低体内IL-17A表达可减轻其肺组织纤维化。本研究制备SSc小鼠模型，同时以抗IL-17A单克隆抗体阻断IL-17A表达；结果发现，与模型组和同型对照组比较，抗体组皮肤厚度明显变薄，肺泡间隔增厚和肺泡结构破坏程度明显减轻，皮肤和肺组织炎症细胞浸润及胶原纤维沉积明显减少，且皮肤炎症评分和肺炎症、纤维化评分亦降低。上述结果说明IL-17A可促进SSc小鼠皮肤和肺炎症、纤维化的发生和发展，而抗IL-17A单克隆抗体可阻断这一过程。

TGF-β1能够促进成纤维细胞的趋化和增殖，并通过诱导细胞外基质合成等发挥促纤维化作用。研究表明，SSc小鼠外周血及皮肤TGF-β1水平均升高，其下游因子CTGF表达水平亦升高[2]。TGF-β1与Th17关系密切，被认为是调节Th17分化的主要细胞因子。既往研究发现，BLM诱导IL-17A的产生依赖于TGF-β1，阻断TGF-β1能够显著抑制BLM和IL-17A诱导的纤维化[12]。前期研究发现，SSc小鼠血清TGF-β1、IL-17A水平均与皮肤、肺纤维化程度呈正相关[14]。本研究模型组、抗体组和同型对照组皮肤和肺组织TGF-β1、CollagenⅠ mRNA相对表达量均明显高于正常对照组，而抗体组上述指标均明显低于模型组及同型对照组，提示拮抗IL-17A可抑制TGF-β1、CollagenⅠ表达，从而延缓SSc小鼠皮肤和肺纤维化病变，与以往研究[15～18]结论一致。

综上所述，IL-17A参与了SSc的炎症及纤维化过程，抗IL-17A单克隆抗体具有抑制SSc小鼠炎症及纤维化的作用；抑制TGF-β1、CollagenⅠ表达可能为其作用机制。IL-17A可能是SSc治疗的新靶点，阻断IL-17A或其信号转导将成为治疗SSc的新途径。

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广西省自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019135)；广西研究生教育创新计划资助项目(YCSZ2014102)。

雷玲(E-mail： leiling1972@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.012

R593.2

A

1002-266X(2016)48-0038-04

2015-01-11)