刘铭，王宇，刘欣伟，刘宪民，张玉彪，项良碧，刘松波

(沈阳军区总医院，沈阳110016)

·基础研究·

脂肪干细胞移植对兔前交叉韧带损伤的修复作用及其机制

刘铭，王宇，刘欣伟，刘宪民，张玉彪，项良碧，刘松波

(沈阳军区总医院，沈阳110016)

目的 观察脂肪干细胞(ADSCs)移植对兔前交叉韧带(ACL)损伤的修复作用，并探讨其对韧带组织转化生长因子β(TGF-β)和Ⅰ型胶原表达的影响。方法无菌条件下切取1只新西兰大白兔的腹股沟下脂肪组织，分离提取ADSCs(经CD43免疫荧光染色证实)。将45只新西兰大耳白兔随机分为假手术组、模型组和移植组，每组15只。模型组和移植组均切断75%的ACL，移植组同时在韧带损伤处注入10 μL第3代ADSCs悬液，假手术组只暴露韧带、不切开。记录术后各组动物饮食、饮水、运动等一般情况，术后第4周处死后采集ACL标本，分别采用实时荧光定量PCR法和Western blotting法检测TGF-β、Ⅰ型胶原mRNA和蛋白相对表达量。结果假手术组麻醉恢复后即可正常饮水饮食，被毛有光泽，精神状态良好，运动情况与术前比较无变化。模型组饮食饮水较少，被毛无光泽，精神状态差，存在运动障碍。移植组饮食饮水情况与假手术组相近，被毛光泽度不佳，精神状态较模型组好，存在轻微运动障碍，但运动能力恢复情况较模型组好。与假手术组比较，模型组和移植组TGF-β mRNA和蛋白相对表达量均升高，Ⅰ型胶原mRNA和蛋白相对表达量均降低(P均<0.05)。与模型组比较，移植组TGF-β mRNA和蛋白相对表达量均降低，Ⅰ型胶原mRNA和蛋白相对表达量均升高(P均<0.05)。结论ADSCs移植可以促进ACL损伤兔的韧带修复；降低TGF-β表达、升高Ⅰ型胶原表达可能是其作用机制。

前交叉韧带损伤；脂肪干细胞；转化生长因子β；Ⅰ型胶原；兔

随着全民健身运动的开展，韧带损伤在创伤骨科中的比例逐渐升高，其中以前交叉韧带(ACL)损伤发病率最高[1～3]。研究表明，干细胞移植可以在移植区域产生新的血管，为创伤恢复和治疗提供了条件[4]。脂肪干细胞(ADSCs)来源比较广泛，容易获取，是目前干细胞移植的研究热点。2014年5月～2015年7月，本研究观察了ADSCs移植修复兔ACL损伤的效果及其对韧带组织转化生长因子β(TGF-β)和Ⅰ型胶原表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：健康成年新西兰大白兔46只，雌雄不限，体质量2.0～3.0 kg，由沈阳军区总医院动物实验科提供。试剂：戊巴比妥钠购于成都化学制剂厂，DMEM培养基、青链霉素、胎牛血清均购于美国Hyclone公司，Ⅰ型胶原酶购于美国Sigma公司，反转录试剂盒购于日本TaKaRa公司，caspase-3和c-fos大鼠抗兔抗体、二抗山羊抗鼠均购于北京索来宝生物科技有限公司。

1.2 兔ADSCs分离、鉴定 ①兔ADSCs分离：随机选取1只新西兰大白兔，采用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉处死，将动物进行消毒，于无菌条件下切取腹股沟下脂肪组织。在体视显微镜下去除脂肪组织上可见的血管和筋膜，无菌预冷PBS缓冲液冲洗3遍，用手术眼科剪将其剪成泥状。加入0.15% Ⅰ型胶原酶3 mL，置于CO2培养箱中消化60 min，消化后将悬液过100目细胞筛。将滤液放入离心机中，1 000 r/min离心10 min；弃上清，采用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行重悬，接种于培养皿中，显微镜下观察细胞形态。②兔ADSCs鉴定：待细胞生长融合至80%～90%时进行传代，细胞传代至第3代时采用载玻片制作细胞爬片，95%乙醇脱水固定。PBS冲洗后吸干水分，滴加一抗放入湿盒内4 ℃过夜，PBS冲洗，加入二抗37 ℃孵育，最后PBS洗净封片，严格按照CD43免疫荧光试剂盒说明进行操作。荧光显微镜下进行观察，以CD43免疫荧光染色呈绿色定义为阳性染色。鉴定结果显示，分离出来的细胞中有较多的杂细胞；培养2天后培养皿中能够见到三角形或小多角形的细胞，大小不一，细胞核较大，传代后细胞分布均匀；ADSCs表面标志因子CD43染色结果呈现阳性。证实分离培养的细胞为ADSCs。

1.3 造模与分组处理 将剩余45只健康新西兰大白兔随机分为假手术组、模型组和移植组，每组15只。各组均采用3%戊巴比妥钠1 mL/kg耳缘静脉缓慢注射麻醉，将动物仰卧位固定于动物解剖台上，剃毛，局部碘伏消毒，切开皮肤，暴露膝关节腔和ACL。模型组将ACL中部切断75%，缝合修复韧带后逐层缝合切口。移植组将ACL中部切断75%，缝合腱膜组织，于韧带损伤处注入10 μL第3代ADSCs悬液(细胞密度为1×106个/μL)，逐层缝合切口。假手术组仅暴露ACL，不切断，然后逐层缝合切口。

1.4 相关指标观察

1.4.1 一般情况及ACL损伤修复情况 记录各组术后饮水饮食、运动等一般情况。术后4周，各组均采用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉处死，取出ACL组织，肉眼观察损伤修复情况后置于-80 ℃保存。

1.4.2 ACL组织TGF-β和Ⅰ型胶原mRNA表达 采用实时荧光定量PCR法。取出ACL组织，于液氮中进行研磨，加入TRIzol试剂，提取总RNA。根据反转录试剂盒说明书进行反转录，反应体系为10 μL，反应条件为37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。TGF-β上游引物：5′-TGCTTCAGCTCCACAGAGAA-3′，下游引物：5′-TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC-3′，片段长度125 bp；Ⅰ型胶原上游引物：5′-GCGGTGGTTACGAC-TTTGGTT-3′，下游引物：5′-AGTGAGGAGGGTCTCAATCTG-3′，片段长度144 bp。以β-actin为内参，上游引物：5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，下游引物：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′，片段长度141 bp。反应体系25 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，变性、退火和延伸共40个循环，72 ℃延伸5 min。以2-ΔΔCt法计算TGF-β和Ⅰ型胶原mRNA相对表达量。

1.4.3 ACL组织TGF-β和Ⅰ型胶原蛋白表达 采用Western blotting法。取各组ACL组织，于冰浴条件下采用匀浆机进行匀浆，提取总蛋白，对提取蛋白进行定量，然后进行蛋白变性、电泳转膜、一抗和二抗孵育，严格按照试剂盒说明书操作。显影定影，拍照后采用图像分析软件对电泳条带灰度值进行分析，以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值表示TGF-β和Ⅰ型胶原蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 实验动物一般情况及ACL损伤修复情况 假手术组麻醉恢复后即可正常饮食饮水，被毛有光泽，精神可，运动情况与术前比较无变化。模型组饮食饮水较少，被毛无光泽，精神状态差，存在明显运动障碍，自主运动能力较差。移植组饮食饮水情况与假手术组相近，被毛光泽度不佳，精神状态较模型组好，存在轻微运动障碍，但运动能力恢复情况较模型组好。移植组肉眼观察不到ACL损伤，与假手术组相近；模型组可见明显的ACL损伤。

2.2 TGF-β和Ⅰ型胶原mRNA表达 与假手术组比较，模型组和移植组TGF-β mRNA相对表达量均升高、Ⅰ型胶原mRNA相对表达量均降低(P均<0.05)。与模型组比较，移植组TGF-β mRNA相对表达量降低、Ⅰ型胶原mRNA相对表达量升高(P均<0.05)。见表1。

表1 各组TGF-β和Ⅰ型胶原mRNA相对表达量比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 TGF-β和Ⅰ型胶原蛋白表达 与假手术组比较，模型组和移植组TGF-β蛋白相对表达量均升高、Ⅰ型胶原蛋白相对表达量均降低(P均<0.05)。与模型组比较，移植组TGF-β蛋白相对表达量降低、Ⅰ型胶原蛋白相对表达量升高(P均<0.05)。见表2。

表2 各组TGF-β和Ⅰ型胶原蛋白相对表达量比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

韧带损伤是指由于各种原因造成韧带撕裂或者断裂，可导致运动功能受限。韧带的主要成分是细胞外基质和基质中间的成纤维细胞，韧带损伤后的愈合期主要是成纤维细胞发挥修复作用[3]。韧带损伤后首先是局部发生出血、炎症反应和细胞增殖，由于韧带是结缔组织，所以损伤时韧带出血导致的血块形成并不明显[2]。在炎症反应初期阶段，损伤部位会出现大量巨噬细胞，其作用是调整促进韧带愈合所必需的环境；炎症反应的后期可出现细胞增殖和胶原产生。因此韧带损伤的愈合是一个长期过程，一般会持续数月至数年[4～6]。

干细胞具有在一定条件下分化成其他细胞的能力，目前已经逐渐应用于临床疾病的治疗，例如造血干细胞移植治疗白血病、脊髓损伤后利用神经干细胞移植促进脊髓神经元再生和功能恢复等。研究发现，间充质干细胞移植能够促进大鼠韧带损伤处干细胞向成纤维细胞分化，从而促进韧带损伤处的愈合[7，8]。但是临床上对于干细胞治疗韧带损伤的研究比较少，尤其是ADSCs移植[9，10]。本研究结果显示，模型组出现明显运动障碍，而移植组仅存在轻微运动障碍，且运动能力恢复情况较模型组好。说明ADSCs移植可促进ACL损伤的修复。

Ⅰ型胶原是韧带的重要组成部分，在韧带中的干重比可达80%，是提高组织伸拉强度的重要因素。在韧带损伤的愈合过程中，Ⅰ型胶原表达可间接反映韧带的愈合情况[11～13]。研究发现，韧带损伤后会产生大量TGF-β，主要是由伤口处释放，可促进瘢痕成熟和抑制韧带愈合[14～16]。本研究结果显示，假手术组、移植组、模型组TGF-β mRNA和蛋白表达依次升高，Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达依次降低。证实ADSCs移植可降低TGF-β表达、升高Ⅰ型胶原表达，可能是其促进损伤韧带修复的机制之一。

综上所述，ADSCs移植可促进ACL损伤兔的韧带修复；降低TGF-β表达、升高Ⅰ型胶原表达可能是其作用机制。本研究为干细胞治疗韧带损伤提供了一定的理论基础，但更多的作用机制还需要深入研究。

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辽宁省科技攻关计划项目(2013020175)；辽宁省自然科学基金资助项目(2013225089)。

刘松波(E-mail： luzongguke@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.008

R686.5

A

1002-266X(2016)48-0028-03

2015-12-14)