刘 峰 董少红吴美善 梁瑞娟 熊 玮 刘华东 陈科奇 林 峰

深圳市人民医院心内科，广东深圳 518100

紫檀芪通过PI3K-AKT信号途径抑制缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡

刘 峰 董少红▲吴美善 梁瑞娟 熊 玮 刘华东 陈科奇 林 峰

深圳市人民医院心内科，广东深圳 518100

目的探讨紫檀芪对缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响，以及对磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路的影响。方法乳鼠心肌细胞经过缺氧/复氧（H/R）处理，再模拟心肌缺血再灌注损伤。实验分为正常组，模型组（H/R），紫檀芪组（H/R+0.5，5，50μmol/L紫檀芪）。MTT法检测各组心肌细胞活力；倒置显微镜拍照检测各组心肌细胞形态；Annexin V-FITC/PI 流式双染法检测各组心肌细胞凋亡； Western blot分析PI3K/AKT激活状况。结果与正常组比较，模型组中心肌细胞皱缩，变圆变亮，细胞活力降低，细胞早期凋亡和晚期凋亡率显著提高，PI3K表达量及AKT磷酸化程度降低，差异均具有显著性（P＜0.05）；与模型组比较，5，50μmol/L紫檀芪组中心肌形态恢复，细胞活力上升，PI3K表达量提高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；0.5，5，50μmol/L紫檀芪组心肌细胞凋亡程度下降，AKT磷酸化水平上升，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论紫檀芪可抵抗缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡，PI3K/AKT信号被激活是其作用表达的主要方式。

紫檀芪；乳鼠心肌细胞；缺氧/复氧；细胞凋亡

细胞凋亡是缺血性心肌损伤的重要表现之一，要使心脏功能得到改善，始终保护缺血/心脏再灌注，心肌细胞减少凋亡数量等，需要激活PI3K-Akt通路[1-3]。紫檀芪Pterostilbene （Pte）具有抗真菌、抗细胞增殖，预防氧化应激反应、抗炎、降血脂等作用，可改善缺血再灌注损伤[4-5]。心肌细胞凋亡（尤其是缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡）与紫檀芪相关的研究数据较少，因此进行了本次研究，阐明Pte对心肌IR损伤的作用（保护作用及可能机制作用），为更好的治疗心肌IR损伤提供了可行的重要依据。

1 资料与方法

1.1 材料

南方医科大学生化实验室提供了本次研究的所有材料与实验仪器。Wistar乳鼠（出生12d）100只，雌雄不做限制。美国Gibco公司提供本次实验所需胰蛋白酶及胰脱氧核糖核酸酶，杭州四季青生物工程材料有限公司提供本次实验的胎牛血及四甲基偶氮唑盐（ MTT）。中国海克隆生物公司提供本次实验的DMEM培养基。瑞士罗氏公司提供本次实验的青霉素及链霉素。抗AKT，p-AKT，PI3K，GADPH单克隆抗体购自购于美国Santncruz公司。紫檀芪，购于日本富士株式会社。本次研究进行前，已经被动物研究委员会准许，研究过程中所选择的动物都受到了人道待遇（依照美国卫生部颁布的《实验动物使用和关爱指南》，NIH颁布86-23，1986年修订）批。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞分离培养 新生乳鼠心肌细胞的分离培养参考已有的文献记载。具体措施为，单个细胞被从Wistar乳鼠（出生12d）的心肌碎片（1～2mm3）中分离出来，分离环境为4℃，应用材料为胰蛋白酶（0.06%），在室温37℃下进行消化（应用胶原酶）45min。之后在同样室温下进行培养1h，培养液为DMEM液[成分为氟脱氧鸟苷、HEPES、胎牛血清FBS、青霉素、链霉素，剂量（浓度）分别为2μmol/L、15mmol/L、5%、100U/mL、100mg/mL]，培养结果为使非心肌细胞贴壁。细胞培养瓶里（25cm2）存放上清中心肌细胞悬液，培养瓶密度在1×105细胞数/ cm2。培养环境为37℃，湿度为5%CO2恒定，培养液应用10%FBS的DMEM培养液，进行3d的培养。

1.2.2 缺氧复氧损伤模型（H/R）的建立及分组 缺氧复氧损伤模型（H/R）的建立是对缺氧溶液与复氧溶液的制备，并且制备过程中应用Koyama等。缺氧为原代乳鼠心肌细胞的正常培养液被缺氧液置替换，并被封闭20min；复氧为缺氧液又被复氧液替换，并进行15min的培养。分为5组，各（20只）：A组：正常对照组（Control）；B组： H/R组；C组：H/R+LPte组；D组：H/R+MPte组； E组： H/R+HPte组。

1.2.3 MTT法（细胞活力检测） 细胞浓度进行调整（在乳鼠心肌细胞处于生长对数期被消化之后），96孔板进行细胞接种，给药方法按照分组情况进行1d的培养，将培养结果倒置在纤维镜下进行观察并拍照，最后进行OD值测定[4h培养（每个孔板加MTT（ 5mg/mL） 20L），将上清去除，再进行10min培养（每个孔板加DMSO 150 L）]。

1.2.4 流式细胞仪检测方法 培养皿（35mm）接种上4×105个细胞（每孔含量），并将个细胞进行消化和离心，选择3个不同时间点（24，48，60h）进行细胞收集。常规消化，PBS洗涤，离心5min，收集细胞； 进行室温下避光反应（5～15min），反应溶液按顺序加入Binding Buffer 500L 悬浮细胞、Annexin V-FITC 5L、与PI 5L混匀，应用流式细胞仪检测1小时内的细胞凋亡数量。

1.2.5 Westernblot检测 消化心肌细胞（处于生长对数期的乳鼠），调整细胞浓（8×103个细胞/ mL），每孔1×104个心肌细胞接种于96孔板，每组3个复孔，继续培养48h后收集细胞。收集细胞样本，预冷PBS洗3次，蛋白提取采用的方法为细胞裂解法，上样缓冲液被加在相同含量蛋白中，使每组蛋白上样量均为30μg，蛋白电泳在凝胶中进行（4%～12% SDS-PAGE），最终聚偏氟乙烯膜PVDF上会有蛋白转移过来，封闭2h的TBS-T缓冲液（5%脱脂奶中），在4℃环境下过夜（分别加入抗Bcl-2，抗Bax，抗Akt，抗Caspase-9和抗α-actin抗体），膜进行3遍清洗后与辣根过氧化物酶联合的二抗（1：2000）孵育1h。Quantity One软件测定灰度值进行半定量分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件。本次研究中的所有实验至少重复3次，计量资料以（）表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫檀芪对缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞形态及活力的影响

如图1表示，与A组比较，B组中心肌细胞皱缩，细胞变圆变亮； 与B组相比，加入Pte组中的细胞形态恢复。如图2表示，与A组比较，B组中心肌细胞活力下降，具有显著性差异（P＜0.05）； 与B组比较，添加Pte组的细胞活力改善，差异具有统计学意义（P＜0.05），抑制高糖诱导的细胞形态异常及活力下降是Pte的显著特点；同时观察到Pte可剂量依赖性提高乳鼠心肌细胞H/R后的生存率。

2.2 紫檀芪对缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响

图1 紫檀芪对缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞形态的影响

图2 紫檀芪对缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞活力的影响

各组组内比较结果：早期凋亡与晚期凋亡之间结果差异具有统计学意义（P＜0.05）；组间比较结果（表1）：与Control组（A组）对比，B组显著提高的是早期凋亡和晚期凋亡的乳鼠心肌细胞数量，并且差异具有统计学意义（P＜0.05）； 与H/R组比较，各个浓度紫檀芪组的乳鼠心肌细胞数减少（早期凋亡和晚期凋亡细胞数），差异具有统计学意义（P＜0.05）。表1中t、P值为组间比较。

表1 紫檀芪影响缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的情况分析（）

表1 紫檀芪影响缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的情况分析（）

注：与Control组比较，▲P＜0.05；与H/R组比较，★P＜0.05，◆P＜0.05

?组别 早期凋亡（%）晚期凋亡（ %） t P Control 0.5±0.2 2.8±0.2 36.4 ＜0.05 H/R 8.9±0.4▲ 34.2±3.1▲ 36.2 ＜0.05 H/R+LPte 8.1±1.3★ 26.4±2.6★ 28.2 ＜0.05 H/R+MPte 6.9±0.6◆ 15.2±1.7◆ 20.6 ＜0.05 H/R+HPte 3.7±0.3◆ 9.5±0.6◆ 38.7 ＜0.05

2.3 紫檀芪对缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞中PI3K/AKT信号通路的影响

与Control组[P13K表达值为（2.2±1.2），AKT磷酸化水平为（0.8±0.1）]比较，H/R组中PI3K表达值为（0.4±0.1）及AKT磷酸化水平为（0.3±0.1），有所降低，具有显著性差异（P＜0.05）； 与H/R组比较，H/R+LPte组PI3K表达值为（0.5±0.1），AKT磷酸化水平为（0.4±0.1）；H/R+MPte组PI3K表达值为（1.2±0.2），AKT磷酸化水平为（0.7±0.1）；E：H/R+HPte组PI3K表达值为（1.4±0.2），AKT磷酸化水平为（1.5±0.3）；各个浓度紫檀芪组PI3K表达量显著提高，具有显著性差异（P＜0.05）；各个浓度紫檀芪组AKT 磷酸化水平显著提高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图3、表2。

图3 紫檀芪对缺氧/复氧诱导乳鼠心肌细胞中PI3K/AKT信号通路的影响

表2 各组P13K表达与AKT磷酸化水平

3 讨论

氧自由基增加，炎性因子浸润，钙离子超载，细胞凋亡等是缺血再灌注损伤发生的重要影响因素，多条凋亡途径会造成缺血再灌注损伤（PI3K/AKT、酪氨酸激酶-信号转导子、转录激活子JAK-STAT等）[6-7]。PI3K/AKT信号通路具有关键作用（在心肌IR损伤中），PI3K/AKT信号通路被激活可能是由于心肌IR引起而导致。AKT的上游激酶为PI3K，磷酸化形式的PI3K蛋白可以反映PI3K/AKT信号通路的活性[8-9]。本次研究表明，p-AKT在模型组中的水平较高，表示IR时PI3K/AKT信号通路被激活，紫檀芪给予后该蛋白的磷酸化形式被进一步提升，表示紫檀芪主要分子作用靶点可能是PI3K/AKT信号通路，通过激活PI3K/AKT信号通路发挥心肌保护效果，紫檀芪促进心肌细胞的增殖存活，同时一氧化氮合成酶eNOS在PI3K/AKT下游靶点被激活，释放一氧化氮NO，从而起到扩张血管改善微循环的作用，进而起到心肌保护作用，但其具体的机制还需进一步探索[10-11]。而对于IR时PI3K/AKT通路本身处于激活状态可能与反馈机制有关[12]。本研究证实紫檀芪能够促进PI3K/AKT信号蛋白的表达减轻心肌损伤，对心肌缺血再灌注起着保护效应。然而在活体动物中，紫檀芪控制着极其复杂的相关信号通路机制[13-16]，对于紫檀芪在PI3K/AKT的变化及缺血再灌注心肌损伤的影响，需要做进一步的研究探索。

本次研究紫檀芪对缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响，同时对磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路的影响进行了分析，选取100只Wistar乳鼠（出生12天）进行实验研究，结果显示：以缺氧复氧损伤B组和控制组A组为对照，C、D、E组乳鼠心肌细胞活力与两组比较有显著差异，P＜0.05；与A组比较B组显著提高的是早期凋亡和晚期凋亡的乳鼠心肌细胞数量，并且差异具有统计学意义（P＜0.05）；与B组比较，C、D、E组的不同浓度紫檀芪的乳鼠心肌细胞数减少（早期凋亡和晚期凋亡细胞数），差异具有统计学意义（P＜0.05）；与A组比较，B组中PI3K表达及AKT磷酸化程度降低，差异具有显著性差异（P＜0.05）；与B组比较，C、D、E组的不同浓度紫檀芪的PI3K表达量显著提高，差异具有显著性差异（P＜0.05）；C、D、E组的不同浓度紫檀芪的AKT 磷酸化水平显著提高，具有显著性差异（P＜0.05）。

紫檀芪对乳鼠心肌细胞凋亡（在缺氧/复氧诱导下）有抑制作用，并能有效提高细胞活力、改善细胞形态、同时激活PI3K/AKT信号通路。

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Pterocarpus on apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes induced by hypoxia / reoxygenation through the PI3K-AKT signal pathway

LIU Feng DONG Shaohong WU Meishan LIANG Ruijuan XIONG Wei LIU Huadong CHEN Keqi LIN Feng
Department of Internal Medicine-Cardiovascular,Shenzhen People's Hospital,Shenzhen 518100,China

ObjectiveTo investigate the effect of Pterocarpus on apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes induced by hypoxia / reoxygenation and the effect of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) / protein kinase B (AKT) signaling pathway.MethodsCardiomyocytes of neonatal rats were subjected to hypoxia / reoxygenation (H / R), and the hearts were subjected to myocardial ischemia-reperfusion injury. The rats were divided into normal group, model group (H / R) and pterocarpus stilbene group (H/R+0.5,5,50μmol/L).Cell viability was measured by MTT assay. Cardiomyocyte morphology was detected by inverted microscope. Annexin V-FITC / PI flow cytometry was used to detect the apoptosis of cardiomyocytes.PI3K/AKT activation was analyzed by Western blot.ResultsCompared with the normal group, the center of model group of muscle cell was shrinkage, rounding and brightening, and the cell viability decreased, early and late apoptosis rate of cells increased significantly. The expression of PI3K and the phosphorylation of AKT in the model group were significantly higher than those in the model group (P＜ 0.05). Compared with the model group, 5, 50mol/L of pterostilbene group center muscle morphological was recovery, cell viability was increased, and the rosewood the expression of PI3K was increased, and the difference was significant (P＜0.05). 0.5,5,50 mol/L pterostilbene group the apoptosis of myocardial cells decreased, the phosphorylation level of AKT increased, the difference was significant (P＜ 0.05).ConclusionPterocarpus can resist cardiomyocyte apoptosis induced by hypoxia / reoxygenation, and activation of PI3K / AKT signal is the main way of its expression.

Pterocarpus stilbene;Neonatal rat cardiomyocytes;Hypoxia/reoxygenation;Cell apoptosis

R285.6

A

2095-0616（2016）21-38-04

2016-09-06）

广东省深圳市博士创新项目（201605004）。

▲通讯作者