何国菊，曹 宇(贵阳学院 生物与环境工程学院/生物控制与资源利用贵州省高校特色重点实验室，贵州 贵阳550005)

复合菌混合发酵马铃薯薯渣与茎叶的工艺研究

何国菊，曹 宇
(贵阳学院 生物与环境工程学院/生物控制与资源利用贵州省高校特色重点实验室，贵州 贵阳550005)

为资源化利用马铃薯薯渣与茎叶，将两者混合后，用黑曲霉、植物乳杆菌和啤酒酵母菌制成的复合菌剂进行接种，通过单因素试验研究茎叶中水分含量、营养成分及菌剂的添加、接种量三因素对薯渣与茎叶混合物发酵效果的影响，并在优化发酵工艺条件下测定了发酵前后产物的重要成分含量。结果表明：优化发酵工艺为当茎叶水分为50%时，在1 000 g按实际比例混合的薯渣与茎叶混合物中添加(NH4)2SO460 g、过磷酸钙95 g，复合菌剂接种量为5%，厌氧发酵20 d。与发酵前相比，优化发酵产物真蛋白含量提高328.26%，蛋白质可消化率提高172.79%，硫铵素、烟酸、叶酸、乳酸、钙、磷含量分别提高6 251.72%、755.32%、767.52%、1 812.50%、111.11%、411.11%；发酵后产品粗纤维含量降低55.53%，尿素和龙葵素残留量均在安全值范围内。因此，接种复合菌剂发酵薯渣与茎叶的混合物，不仅可改善饲料的品质，还可提高饲料的安全性。

复合菌； 混合； 发酵； 马铃薯薯渣； 马铃薯茎叶

每生产1 t马铃薯淀粉将产生5 t左右薯渣，对马铃薯薯渣最经济的利用方式是直接作为禽畜饲料。但鲜薯渣蛋白质含量低，直接食用不能满足家畜营养需求，且薯渣含水量高达80%左右，呈现出典型的胶体特性，若烘干制成干饲料则成本过高，导致其成为废弃物并造成环境污染[1-2]。资源化利用营养物质成为马铃薯薯渣处理的关键。马铃薯鲜渣中粗蛋白含量为1%，粗脂肪含量为0.16%，粗纤维和果胶含量均为9.4%，糖类含量约为1%[3]，是良好的微生物基质。因此，前人利用马铃薯薯渣进行液态或固态发酵制备饲料[4-5]，但液态发酵多为耗氧发酵，能源成耗高；薯渣干制成本高,以鲜薯渣进行固态发酵，须添加米糠、麦麸等吸收剂吸收水分，又需增加额外成本。我国马铃薯茎叶资源年产量达1.2亿～1.8亿t[6]，马铃薯茎叶干物质中，粗蛋白含量占16.2%、粗纤维含量占20.8%、粗脂肪含量占1.8%[7]，具有较好饲用价值。但马铃薯茎叶龙葵素含量高、适口性差，不宜直接饲喂，大部分被农户丢弃。目前,对马铃薯茎叶的利用主要是作为青贮饲料使用[8]，但因其茎叶中糖含量较低(0.3%～0.8%)，不利于乳酸菌繁殖，单独发酵腐烂比较严重[9-10]。考虑到马铃薯薯渣和茎叶一定程度上营养互补，且预处理后的马铃薯茎叶还可降低薯渣黏度、吸收薯渣多余水分，因此，本研究将马铃薯薯渣和预处理后的马铃薯茎叶按实际所得比例混合，采用多菌协生混合发酵[3]，以黑曲霉菌(Aspergillusniger)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)与啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的复合菌剂接种进行固态发酵生产单细胞蛋白质饲料，变废为宝，为薯渣和茎叶的综合利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料来源和培养基主成分的制备

马铃薯茎叶和块茎均来自于贵阳农户种植的同一品种马铃薯。其中，茎叶在收薯前的3～5 d收割，晾晒一定时间后，切细至2 cm备用，完成马铃薯茎叶预处理；将得到的马铃薯块茎在实验室中模拟工厂生产淀粉的工艺自制马铃薯薯渣。薯渣与鲜茎叶的质量比为4∶5，将薯渣与预处理后茎叶按实际所得比例混合，作为培养基使用。

1.2 菌剂的制备

黑曲霉菌、植物乳杆菌、啤酒酵母均为本实验室保存菌种。

菌种活化与扩大培养：黑曲霉菌于麦芽汁液体培养基中28 ℃活化培养72 h，然后取10 mL于马铃薯培养基(马铃薯200 g、蔗糖20 g、水1 000 mL，pH值自然)上培养72 h，备用；植物乳杆菌于液体种子培养基 (蛋白胨1%、牛肉膏1%、葡萄糖4%、乙酸钠0.5%、酵母膏0.5%、柠檬酸二铵0.2%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.02%[11])中36 ℃培养12 h，然后取10 mL于马铃薯培养基上培养12 h，备用; 啤酒酵母于基础培养基(葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L)中28 ℃培养24 h，然后取20 mL分装于装有麦芽汁培养基的三角瓶中，无菌条件下每瓶接入活化后酵母菌2满环，28 ℃,160 r/min摇床培养24 h。

复合菌剂的制备：根据预试验结果，复合菌剂为扩大培养后的黑曲霉菌、啤酒酵母与植物乳杆菌按2∶2∶1体积比混合而成。

1.3 发酵工艺的优化

将薯渣与茎叶的混合物加入带盖塑料桶(规格为5 L)中，添加氮源、过磷酸钙、菌剂，拌匀，桶面上盖1层塑料膜密封。室温(约10～20 ℃)条件下厌氧发酵 20 d。

1.3.1 茎叶水分对发酵效果的影响 取同质量新鲜马铃薯茎叶7份,分别晾晒0、8、16、24、32、40、48 h后得到含水量86%、70%、62%、50%、44%、37%、30%的马铃薯茎叶，切细，按实际比例加入同来源薯渣，混匀后各取出1 000 g，分别加入(NH4)2SO460 g、过磷酸钙95 g，根据薯渣与茎叶的混合质量按接种量5%添加复合菌剂，发酵20 d。然后测定各份产物中真蛋白含量，评价发酵产物感官特征。

1.3.2 添加营养成分及菌剂对发酵效果的影响 根据预试验结果,试验设置6个处理，处理1：对照，将1 000 g薯渣与茎叶的混合物置入桶中，不加任何物料，发酵20 d； 处理2：不发酵处理，在1 000 g薯渣与茎叶的混合物中加入尿素60 g、过磷酸钙95 g，根据薯渣与茎叶的混合质量按接种量5%添加复合菌剂(下同)，拌匀，直接取样测定；处理3：在1 000 g薯渣与茎叶的混合物中加入尿素60 g、过磷酸钙95 g，菌剂接种量为5%，拌匀，发酵20 d；处理4：在1 000 g薯渣与茎叶的混合物中加入尿素60 g，菌剂接种量5%，拌匀，发酵20 d；处理5：在1 000 g薯渣与茎叶的混合物中加入(NH4)2SO460 g、过磷酸钙95 g，菌剂接种量5%，拌匀，发酵20 d；处理6：在1 000 g薯渣与茎叶的混合物中加入NaNO360 g、过磷酸钙95 g，菌剂接种量为5%，拌匀，发酵20 d。测定以上6种处理产物的真蛋白含量。

1.3.3 复合菌接种量对发酵效果的影响 将薯渣与含水量50%左右的马铃薯茎叶按实际比例混合加入塑料桶中，按其质量的6%添加 (NH4)2SO4、9.5%添加过磷酸钙，根据薯渣与茎叶的混合质量分别接种1%、3%、5%、7%、9%的复合菌剂，拌匀装入桶中，室温厌氧发酵 20 d，分别测定5种接种量处理发酵产物的真蛋白含量。

1.4 优化后发酵工艺的效果

根据1.3筛选得到的优化工艺，将预处理后水分为50%的马铃薯茎叶与马铃薯薯渣按质量比1∶1.1混合，取2份该比例的混合物。第一份直接取样，用作对照；在另一份混合物中添加(NH4)2SO460 g、过磷酸钙95 g，按接种量5%添加复合菌剂，置入桶中密封处理，厌氧发酵20 d。分别测定发酵前、后薯渣与茎叶混合物中硫胺素、烟酸、叶酸、真蛋白、钙、磷、尿素、龙葵素等的含量及蛋白质可消化率。

1.5 测定项目及方法

水分含量测定采用减压干燥法(GB/T 14769—93)；真蛋白含量测定采用硫酸铜沉淀—凯氏定氮法[12]；蛋白质可消化率参照文献[13]制样并用甲醛法检测消化前后样品中氮含量并计算；硫铵素含量测定采用GB/T 5009.84—2003；叶酸含量测定采用GB/T 5009.211—2008；烟酸含量测定采用GB/T 5009.89—2003；粗纤维含量测定采用酸碱处理法(GB 5009.10—85);磷含量测定采用钼蓝比色法(GB/T 12393—1990);钙含量测定采用乙二胺四乙酸二钠络合滴定法(GB/T 6436—2002)；尿素含量测定采用二甲氨基苯甲醛比色法[14]；酸度测定采用GB/T 5517—2010；乳酸含量测定参照NY 82.12—1988;龙葵素含量测定采用乙醇-乙酸法双溶剂提取—HPLC法[15]。

2 结果与分析

2.1 马铃薯茎叶含水量对发酵效果的影响

由表1可知，随着茎叶含水量的减少，发酵产物真蛋白含量先增加后降低。当茎叶含水量为50%时，发酵产物真蛋白含量最高,有酒香味和淡淡的酸香味，无腐败和恶臭气味，拿到手里感到松散、质地柔软、湿润。环境中水分直接影响微生物生长，水分含量为50%的茎叶与薯渣混合后，培养基含水量在67%左右，适合微生物对水分的要求(65%～70%)[4]。在薯渣中加入预处理后含一定水分的马铃薯茎叶，而不是添加干制后的马铃薯茎叶，不仅可以节约干制茎叶的成本，还可降低茎叶干制过程中引起的霉菌滋生和营养成分损失[16]。因此，选择水分含量50%的马铃薯茎叶与薯渣混合后作为培养基使用。

表1 马铃薯茎叶含水量对发酵效果的影响

注：以干物质计算真蛋白含量，下同。

2.2 添加营养成分及菌剂对发酵效果的影响

据表2可见，处理3、4、5、6发酵产物真蛋白含量明显高于处理1、2，说明培养基中加入营养成分和接入菌剂有助于提高发酵产物蛋白质含量。处理3真蛋白含量比处理4高20.8%，表明添加过磷酸钙有助于发酵。比较尿素、(NH4)2SO4和NaNO3(处理3、5、6)3种氮源对发酵产物蛋白质含量的影响发现，(NH4)2SO4的效果最好，NaNO3的效果最差。处理5发酵产物真蛋白含量比处理2高3.8倍以上，说明添加菌剂进行发酵大幅度提高了蛋白质含量。因此，1 000 g薯渣与茎叶的混合物中添加(NH4)2SO460 g、过磷酸钙95 g，按接种量5%添加复合菌剂，置入桶中密封处理，厌氧发酵20 d，发酵效果最好。

表2 添加营养成分及菌剂对发酵产物真蛋白含量的影响

2.3 复合菌剂接种量对发酵效果的影响

由表3知，随着复合菌剂接种量的增加，发酵产物中真蛋白含量先增加后趋于稳定，当复合菌剂添加量为5%、7%、9%时，发酵产物中真蛋白含量分别为19.3%、19.5%、19.4%，说明复合菌剂添加量为5%时即可满足发酵对菌剂量的要求。故菌剂接种量确定为5%。复合菌中的3种微生物均为微生物饲料生物安全通用技术准则附录中所规定使用的生产菌种。试验中采用乳酸菌和酵母，不仅可提高饲料中的蛋白质含量，因发酵产物有乳酸和乙醇，还能改善饲料风味，提高牲畜的食欲；加入黑曲酶，利用培养基中残余的氧气，有利于培养基中的纤维素分解成糖类物质，补充营养源，还可促进乳酸菌和酵母对培养基的后续发酵。

表3 复合菌剂接种量对发酵效果的影响

2.4 优化工艺发酵前后重要指标的测定结果

由表4 可知，薯渣与茎叶混合物发酵后真蛋白含量较发酵前提高328.26%，蛋白质可消化率提高172.79%。蛋白质降解为肽、短肽和氨基酸后，才能被动物吸收利用，采用蛋白质可消化率评价蛋白质的营养价值最准确。因此，发酵后真蛋白数量和品质都大幅度提高。

发酵前，薯渣与茎叶混合物中硫胺素、烟酸和叶酸3种维生素含量较少，发酵后三者含量分别提高了6 251.72%、755.32%、767.52%，这3种维生素对动物均有重要生理功能。说明接入复合菌剂发酵，有利于提高饲料维生素含量。

厌氧发酵产品质量可用乳酸含量和pH值评价，优质青贮饲料pH值一般小于4.20，同时乳酸含量高[17]。高含量乳酸引起的低pH值可降低有害微生物数量，从而提高发酵品质。由表4可知，发酵前薯渣与茎叶混合物中乳酸含量为0.08%，发酵后为1.53%，乳酸含量提高了1 812.50%；发酵前pH值为6.14，发酵后pH值为3.87，低于4.20，说明发酵效果较好。

复合菌剂处理薯渣与茎叶混合物发酵后粗纤维含量(17.3%)比处理前(38.9%)降低55.53%，这是复合微生物共同协作的结果，微生物让纤维结构更为松散和暴露，有利于纤维素复合酶酶解纤维素。钙、磷是动物骨骼和牙齿的组成元素，发酵产物中钙、磷含量较发酵前分别增加了111.11%、411.11%。

饲料中尿素含量安全值为不超过1%[14]，安全值下尿素对牲畜发育无害，发酵产物可作为粗饲料使用[18]。由表4可知，薯渣与茎叶混合物发酵前尿素添加量为6.0%，发酵后尿素含量降低为0.8%，尿素含量大幅度降低说明其在发酵时作为氮源被微生物消耗。发酵后尿素残留量(0.8%)低于1%，表明发酵产物可作为畜禽饲料使用。马铃薯植株和块茎中都含有龙葵素，人、畜超量摄入龙葵素后会引起急性中毒,严重时危及生命。薯渣与茎叶混合物发酵前龙葵素含量为0.19%，发酵后降低了84.21%，仅为0.03%。这可能是龙葵素在碱性条件下稳定存在，酸性条件下分子结构中糖苷键发生水解[19]，发酵后低pH值使龙葵素水解而含量降低。发酵后龙葵素含量(0.03%)也低于龙葵素含量安全值(100 mg/kg)[20]。

表4 发酵前后薯渣与茎叶混合物中重要指标的变化

3 结论与讨论

本研究表明，在1 000 g薯渣与茎叶(含水量50%)按实际比例混合的混合物中，添加(NH4)2SO460 g、过磷酸钙95 g，复合菌剂(以黑曲霉、植物乳杆菌和啤酒酵母3种菌种制成)接种量为5%，厌氧发酵20 d，与发酵前相比，发酵产物中真蛋白含量提高328.26%，蛋白质可消化率提高172.79%；硫胺素、烟酸、叶酸、乳酸、钙、磷含量分别提高了6 251.72%、755.32%、767.52%、1 812.50%、111.11%、411.11%；粗纤维含量降低55.53%、尿素和龙葵素残留量均在安全范围内。因此，通过复合菌剂发酵薯渣与茎叶的混合物，不仅可提高饲料的品质和安全性，还可以扩大饲料资源。

本研究采用生料固态发酵薯渣与茎叶的混合物,与液态发酵相比，具有简易、低投资、低能耗等优点，可把发酵底物、菌体及其代谢产物全部利用，既可保留活性成分又不产生废液污染。薯渣与茎叶的混合物中添加复合菌剂后发酵，真蛋白含量提高328.26%，原因是微生物大量繁殖，单细胞蛋白含量的提高引起发酵产物蛋白质含量增加。单细胞蛋白营养丰富，含有18～20种氨基酸，富含多种维生素。本研究采用复合菌剂对薯渣与茎叶的混合物进行接种，植物乳杆菌和酵母菌均为益生菌，能够改善畜禽的肠道环境，提高畜禽免疫力。在复合菌剂作用下，产生乙醇、乳酸和醋酸，这些发酵产物的积累，既可保持饲料不腐败，又能改善其营养价值和适口性。

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Study on Fermentation Technique of Potato Residue and Its Stem andLeaves by Compound Bacteria

HE Guoju,CAO Yu
(College of Biology and Engineering of Environment,Guiyang Univcrsity/Key Laboratory of Pest Control & Resource Utilization,Guiyang 550005,China)

For resource utilization of potato residue and its stem and leaves,the compound bacteria,which consisted ofAspergillusniger,LactobacillusplantarumandSaccharomycescerevisiae,was added into the mixture of above waste.The effects of content of water in stem leaves,the addition of nutritional components and bacteria,and inoculation amount of compound bacteria on the fermentation were studied through single factor experiment.Under the optimum fermentation process condition,the important compositions of mixture were determinate before and after fermentation.The results showed that the optimum process parameters were as follows: the content of water in stem leaves was 50%;95 g superphosphate and 60 g (NH4)2SO4were added into the 1 000 g mixture of residue and stem leaves which were mixed according to the practical ratio;the compound bacteria were added according to 5% inoculation amount;the fermentation was implemented in anaerobic environment for 20 days.Compared with that before fermentation,the pure protein content improved by 328.26%,the protein digestion improved by 172.79%,and the content of thiamine,nicotinic acid,folic acid,lactic acid,Ca and P increased by 6 251.72%,755.32%,767.52%,1 812.50%,111.11%,411.11% respectively in the product after fermentation;and the crude fiber content reduced by 55.53%,the contents of urea and solanine were both within the safety value after fermentation.As a conclusion,the fermentation of mixture of potato residue and its stem leaves by compound bacteria not only improved the feed quality,but also increased the feed safety.

compound bacteria; mixture; fermentation; potato residue; potato stem and leaves

2016-02-25

贵阳市创新人才计划青年科技人才培养补助项目(筑科合同[2012HK]号);贵州省联合基金项目(黔科合J字LKG[2013]19号，黔科合J字LKG[2013]03号)

何国菊(1978-)，女，四川华蓥人，副教授，博士，主要从事天然产物化学方面的研究。E-mail:643159250@qq.com

S963.5；S532

A

1004-3268(2016)09-0158-05