张弯弯，贾永芳，梁婷婷，张瑞华，杜启艳，常重杰(河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007)

4种农药对黄河鲤胚胎和仔鱼的急性毒性研究

张弯弯，贾永芳，梁婷婷，张瑞华，杜启艳，常重杰*
(河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007)

为了检测乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡虫啉4种常见农药对水生生物的毒性，以黄河鲤胚胎和仔鱼为材料，研究4种农药的急性毒性效应。在鲤鱼胚盘隆起期、原肠胚中期、神经胚期、尾芽期分别进行药物处理(未施用农药处理为对照)，研究 4种农药对黄河鲤胚胎孵化率和畸形率的影响。结果表明，乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡虫啉处理组胚胎最低孵化率分别为44.77%、50.68%、43.50%、51.26%，极显著低于对照组；最高畸形率依次为43.75%、51.10%、61.91%、52.07%，极显著高于对照组；黄河鲤胚胎对农药的最敏感时期集中于原肠胚中期和神经胚期。在仔鱼的急性毒性试验中，乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯、吡虫啉对黄河鲤仔鱼的96 h半致死质量浓度(LC50)分别为0.118 9 mg/L、0.743 2 mg/L、1.126 5 μg/L、12.940 8 mg/L。可见，4种农药对黄河鲤胚胎和仔鱼具有剧毒或高毒性效应，应适量施用。

农药； 黄河鲤； 胚胎； 仔鱼； 急性毒性

我国是农药生产和使用大国，农药在提高作物产量，防治病虫害等方面起着不可低估的作用[1-2]。据统计，我国年均农药使用量为50万t左右，单位面积化学农药的平均用量比世界发达国家高2.5～5.0倍。农药作为一种有毒的化学药剂，长期大量使用所带来的生态环境问题已经引起了人们的广泛关注和重视[3]。在施用过程中，仅有1%左右的农药作用于靶生物，其余的或残留于土壤，或通过间接途径进入水环境，从而影响土壤生物和水生生物[4-6]。未被靶植物吸收的除草剂通过各种方式扩散，对环境中其他生物造成危害，并通过食物链威胁到人类的健康[7-8]。近年来，许多专家学者着重就除草剂和杀虫剂等农药的分布情况、药效试验、动植物残留等开展了较为系统的研究[9-10]，然而有关乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡虫啉对鲤鱼的毒性研究尚未见报道。

鲤鱼是世界上重要的养殖经济鱼类，具有品种性状稳定、生长速度快、成活率高等优点，作为主导的鲤科鱼类之一，鲤鱼在全球100多个国家养殖，其产量占全球每年淡水养殖产量的10%[11]。黄河鲤(Cyprinuscarpio)产于黄河水域，是我国北方的主要淡水养殖品种[12]，也是河南省的特色鲤鱼。水环境与鱼类的生长和繁殖有着极为密切的关系，特别是对鱼类胚胎发育的影响更为明显。鉴于此，检测了乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡虫啉4种常见农药对黄河鲤胚胎和仔鱼的毒性，以期为水环境污染的生物监测、制定合理的农药使用标准提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

黄河鲤取自河南师范大学生命科学学院水产养殖场。挑选体质健康、无伤、无病、发育成熟的3龄黄河鲤，经过人工授精得到胚胎。胚胎孵化后3 d为试验用仔鱼，从中挑选健康活泼和体表无损的个体，体长0.8～1 cm, 体质量0.3～0.5 g，试验用水为充分曝气的自来水，试验期间水温20～25 ℃，pH值 6.5～7.5。

4种农药分别为2种除草剂：乙羧氟草醚(fluoroglycofen)购自淄博新农基农药化工有限公司，五氟磺草胺(penoxsulam)由美国陶农科公司开发；2种杀虫剂：高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)为第3代新型菊酯类杀虫剂[13]，吡虫啉(imidacloprid)，化学名称为1-(6-氯吡啶-3-吡啶基甲基)-N-硝基亚咪唑烷-2-基胺，中文别名灭虫精、蚜虱净等[14]，均购自新乡市东海农资市场。

1.2 方法

1.2.1 4种农药对黄河鲤胚胎的急性毒性试验 对4种农药分别进行预试验，得出黄河鲤从受精到仔鱼全部存活和使其全部死亡的最高质量浓度和最低质量浓度。根据预试验设定试验质量浓度,乙羧氟草醚：0(对照，A)、0.025 0(B)、0.050 0(C)、0.100 0(D)、0.200 0(E)、0.400 0(F) mg/L，五氟磺草胺：0(对照，A)、0.312 5(B)、0.625 0(C)、1.250 0(D)、2.500 0(E)、5.000 0(F) mg/L；高效氯氟氰菊酯：0(对照，A)、0.312 5(B)、0.625 0(C)、1.250 0(D)、2.500 0(E)、5.000 0(F) μg/L；吡虫啉：0(对照，A)、1.562 5(B)、3.125 0(C)、6.250 0(D)、12.500 0(E)、25.000 0(F) mg/L。每种农药设6个质量浓度梯度，每个质量浓度设3个平行。每组随机投放胚胎，每隔24 h分别更换一次相同体积、相同质量浓度的农药稀释液。选取4个发育时期开始处理，分别为胚盘隆起期、原肠胚中期、神经胚期、尾芽期，测定黄河鲤的孵化率和畸形率。

1.2.2 4种农药对黄河鲤仔鱼的急性毒性试验 根据预试验，应用与胚胎急性毒性相同的药物质量浓度处理黄河鲤仔鱼，每组均随机投放鲤鱼仔鱼30尾，设定每隔24 h分别更换一次相同体积、相同质量浓度的农药稀释液，暴露后连续观察，记录96 h鲤鱼仔鱼的死亡率和中毒症状，试验共重复3次。

采用改进寇氏法[15-16]，计算出半数致死质量浓度(LC50)。LC50的计算公式为:

logLC50=Xm-i(Σp-0.5)。

式中，Xm为试验组最大剂量的对数，i为相邻组质量浓度对数之差，p为各组的死亡率，Σp为各组死亡率的总和。

1.3 数据处理

所有的试验数据均采用Excel进行处理，采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 4种农药对黄河鲤胚胎的急性毒性

2.1.1 4种农药对黄河鲤胚胎孵化的影响 从表1可以看出，4种农药在黄河鲤胚胎所有发育时期处理时，随染毒剂量的增加胚胎孵化率均呈现逐步降低的趋势。

在神经胚期，0.400 0 mg/L乙羧氟草醚浓度组的鲤鱼胚胎孵化率最低(44.77%)，与对照组(88.48%)相比差异极显著；五氟磺草胺染毒时，在原肠胚期和尾芽期，最低质量浓度组(0.312 5 mg/L)胚胎孵化率与对照组相比差异不明显，5.000 0 mg/L质量浓度组在神经胚期染毒时孵化率最低(50.68%)，与对照组(91.69%)相比差异极显著；高效氯氟氰菊酯染毒时，最低孵化率(43.50%)出现在5.000 0 μg/L质量浓度组原肠胚期；吡虫啉最高质量浓度(25 mg/L)处理组在原肠胚期胚胎孵化率最低(51.26%)，与对照组(91.07%)相比极显著下降。综上，黄河鲤胚胎对农药的最敏感时期集中于原肠胚中期和神经胚期。

表1 4种农药对黄河鲤胚胎孵化率的影响 %

注：*、** 分别表示与对照组相比差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)，下同。

2.1.2 4种农药对黄河鲤胚胎畸形的影响 4种农药处理后，黄河鲤胚胎畸形形态有7种类型：心包囊肿、脊椎弯曲、尾部弯曲、脊椎弯曲伴有心包囊肿、断尾、断尾伴有心包囊肿、躯体萎缩伴有心包囊肿(图1)。从表2可以看出，乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡虫啉最低质量浓度处理组的胚胎畸形率分别为16.72%、15.57%、14.56%、12.29%，与对照组相比差异不明显；最高质量浓度组胚胎畸形率分别为43.75%、51.10%、61.91%、52.07%，极显著高于对照组。随着药物质量浓度的增加，4种农药对黄河鲤胚胎的致畸作用均呈增强趋势。

a.形态正常; b.心包囊肿; c.尾部弯曲; d.脊椎弯曲伴有心包囊肿; e.脊椎弯曲; f.断尾伴有心包囊肿; g.断尾; h.躯体萎缩伴有心包囊肿图1 试验组黄河鲤胚胎的畸变形态

2.2 4种农药对黄河鲤仔鱼的急性毒性

黄河鲤仔鱼在4种农药的不同质量浓度处理下表现出中毒症状，处理10～30 min后仔鱼个体急速游动，4周分散，不停地把头伸出水面；随着处理时间延长，仔鱼脊椎弯曲、原地打转游动、甚至肚皮翻转；死亡时，仔鱼眼睛外凸，身体弯曲抽搐。各处理组不同质量浓度造成的鲤鱼仔鱼死亡率见表3，其中，乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡虫啉组鲤鱼最高死亡率分别达到75%、100%、90%、65%，较对照组死亡率依次上升75、95、90、65个百分点，且在96 h内，随着染毒剂量的增高，仔鱼死亡率随之呈明显上升趋势。

表3 4种农药对黄河鲤仔鱼96 h死亡率的影响

3 结论与讨论

鱼类胚胎和仔鱼时期对水环境毒物较为敏感，对胚胎和仔鱼展开低毒毒物的毒性效应研究在水环境生物监测中具有重要意义[17-19]。目前，有关斑马鱼、金鱼、草鱼的胚胎毒性研究已有不少报道[20-21]。相比于成体，以胚胎和仔鱼为试验材料具有成本更低廉的优点。因此，胚胎和仔鱼的急性毒性试验也是研究毒物对鱼类毒性效应的有效方法[22]。

黄河鲤胚胎的急性毒性试验以胚胎孵化率和畸形率为指标，分析2种水稻除草剂和2种杀虫剂对黄河鲤胚胎的毒性效应。本研究发现，在各个发育时期中，随着处理时间的延长和处理剂量的增大，胚胎的孵化率呈下降趋势，畸形率呈逐渐升高趋势。农药对于鲤鱼胚胎的形态建成具有严重的畸变影响。夏勇等[23]在丁草胺对斑马鱼胚胎发育毒性影响研究中发现，斑马鱼胚胎具有脊椎弯曲、心包囊肿、骨骼畸形3种畸变形态，本研究中观察到7种明显畸形形态，其中大部分畸形均有弯背的症状，与Zhu 等[24]的研究结果类似。可见，4种农药强烈抑制黄河鲤胚胎孵化率并且对其形态发育有致畸作用。

鲤鱼胚胎对4种农药反应呈现的最敏感时期存在着较大的差异，乙羧氟草醚和五氟磺草胺各质量浓度组在神经胚期对胚胎孵化率影响最大，高效氯氟氰菊酯和吡虫啉则在原肠胚中期对胚胎孵化率影响最大。这种差异可能是由于鲤鱼胚胎对于毒物的吸收和代谢途径不同所导致的。虽然黄河鲤胚胎对4种农药最敏感的时期不同，但其最敏感时期集中于原肠胚中期和神经胚期，与吴小华[25]分析8-羟基喹啉、油烟清洁剂对2种泥鳅的毒性研究结果相似。表明，原肠胚中期和神经胚时期的鲤鱼胚胎发育更容易受到外界的干扰，此时鲤鱼胚胎各个胚层开始分化，器官原基开始形成，物质代谢加速，可能更易受到环境的影响。

农药通常参照药理学中LC50大小来划分有毒物质对鱼类毒性强弱的标准(剧毒：<1 mg/L；高毒：1～100 mg/L；中毒：100～1 000 mg/L；低毒：1 000～10 000 mg/L；微毒：>10 000 mg/L[26])，依据4种农药对于黄河鲤仔鱼急性毒性96 h的LC50，乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯LC50均小于1 mg/L，属于剧毒，吡虫啉属于高毒。本研究中4种农药毒性大小为高效氯氟氰菊酯>乙羧氟草醚>五氟磺草胺>吡虫啉。因此，在鱼类的繁殖季节，要对农药的用量进行严格的把控，避免不合理用药给鲤鱼及其他鱼类的胚胎和仔鱼带来危害。

[1] 胡玲玲,刘慧君,赵媛.农药对环境生物的安全性评价[J].现代农业科学,2008,5(7):36-38.

[2] 黄五星,白晓婷,许自成,等.辽宁植烟土壤重金属含量和农药残留量调查与评价[J].河南农业科学,2016,45(1):57-60.

[3] 陈鹏飞,杨德强,邹红,等.两种中草药组方对鲫鱼肝脏转氨酶的影响[J].饲料工业,2005,26(6):28-31.

[4] 王乐新,陈丹萍,赵志敏,等.几种常见农药的光谱特性研究[J].河南农业科学,2015,44(4):95-96.

[5] 沈国兴,严国安,彭金良,等.农药对藻类的生态毒理学研究Ⅱ:毒性机理及其富集和降解[J].环境科学进展,1999,7(6):131-139.

[6] Giri A,Yadav S S,Giri S,etal.Effect of predator stress and malathion on tadpoles of Indian skittering frog[J].Aquatic Toxicology,2012,106(1):157-163.

[7] Bidleman T F.Atmospheric transport and air-surface exchange of pesticides[J].Water,Air,and Soil Pollution,1999,115(1/4):115-166.

[8] May P D R,Smith S B.Acute bioassays and hazard evaluation of representative contaminants detected in great lakes fish[J].Environmental Toxicology and Chemistry,1987,6(11):901-907.

[9] Harrie F G,Van D,Robert G.Atmospheric dispersion of current-use pesticides:A review of the evidence from monitoring studies[J].Water,Air,and Soil Pollution,1999,115(1):21-70.

[10] Van Pul W A J,Bidleman T F,Brorström-Lundén E,etal.Atmospheric transport and deposition of pesticides:An assessment of current knowledge[J].Water,Air,and Soil Pollution,1999,115(1):245-256.

[11] Bostock J.Aquaculture:Global status and trends[J].Phil Trans R Soc B,2010,365:2897-2912.

[12] 杨丽华,方展强,郑文彪.重金属(镉、铜、锌和铬)对鲫鱼的急性毒性及安全浓度评价[J].华南师范大学学报,2003,12(3):101-106.

[13] 詹刘满.新型菊酯类杀虫剂功夫的合成及应用[J].陕西化工,1999,28(1):9-10.

[14] Linton S J,Hellsing A L,Andersson D.A controlled study of the effects of an early intervention on acute musculoskeletal pain problems[J].Pain,1993,54(3):353-359.

[15] 张毓琪,陈叙龙.环境生物毒理学[M].天津:天津大学出版社,1993:257-258.

[16] 惠秀娟.环境毒理学[M].北京:化学工业出版社,2003：270-271.

[17] 贾秀英.镉对泥鳅仔鱼的急性和亚急性毒性研究[J].环境污染与防治,2001,23(5):227-228.

[18] Nagel R,Dar T.The embryo test with the ZebrafishDaniorerio—A general model in ecotoxicology and toxicology[J].Altex,2002,19(1):38-48.

[19] Braunbeck T,Boettcher M,Hollert H,etal.Towards an alternative for the acute fish LC(50)test in chemical assessment:The fish embryo toxicity test goes multi-species—An update[J].Altex,2005,22(2):87-102.

[20] Li Y,Wang W M.Toxicity and teratogenic effects of busulfan in early developing embryo and larva of Zebrafish(Daniorerio)[J].Ecological Science,2008, 27(5):368-375.

[21] 柳学周,徐永江,兰功刚.几种重金属离子对半滑舌鳎胚胎发育和仔稚鱼的毒性效应[J].海洋水产研究,2006,27(2):33-42.

[22] 王君,肖静,王琼琼,等.苏丹红Ⅲ对泥鳅胚胎发育的毒性研究[J].河南农业科学,2012,41(11):143-146.

[23] 夏勇,傅剑云,郑云燕,等.丁草胺对斑马鱼及其胚胎发育毒性影响的研究[J].浙江预防医学,2011,23(1):11-16.

[24] Zhu B,Liu L, Li D L,etal.Developmental toxicity in rare minnow(Gobiocyprisrarus) embryos exposed to Cu,Zn and Cd[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2014,104(2):269-277.

[25] 吴小华.8-羟基喹啉油烟清洁剂对两种泥鳅的毒性研究[D].新乡:河南师范大学,2010.

[26] Nori D,Valentine E,Bs H.Content of heavy metals in some fish species in the section of the Danube flowing through Vojvodina[J].Aerospace Medicine,1970,41 (11):79-86.

Acute Toxicity of Four Pesticides on Embryo and Larvae of Yellow River Carp(Cyprinuscarpio)

ZHANG Wanwan,JIA Yongfang,LIANG Tingting,ZHANG Ruihua,DU Qiyan,CHANG Zhongjie*
(College of Life Science,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China)

In this study,four pesticides fluoroglycofen,penoxsulam,lambda-cyhalothrin,imidacloprid were investigated for their acute embryo and larvae toxicity on Yellow River carps.After exposure to four pesticides from blastodisc forming, gastrula,neurulation and tail bud stage respectively(the control group without pesticide),the hatching rate and teratogeny rates were recorded.The results showed that the least embryo hatching rate of fluoroglycofen,penoxsulam,lambda-cyhalothrin,imidacloprid treatment groups (44.77%,50.68%,43.50%,51.26%) were significant lower than that of control;the highest teratogeny rate (43.75%,51.10%,61.91%,52.07%) were significant higher than that of control,the most sensitive toxicity effect caused by pesticides occured at gastrula and neurula stage.Through acute larvae toxicity experiments,the LC50(96 h) of fluoroglycofen,penoxsulam,lambda-cyhalothrin,imidacloprid in Yellow River carp larvae were 0.118 9 mg/L,0.743 3 mg/L,1.122 6 μg/L,12.940 8 mg/L respectively.In summary,four kinds of pesticides all showed highly toxic to Yellow River carp and should be used reasonably.

pesticide； Yellow River carp； embryo； larvae； toxicity

2016-03-26

国家自然科学基金项目(31200923，U1204329)；河南省基础与前沿技术项目(142300410164)；河南省科技攻关项目(142102310045)；河南省教育厅自然科学研究项目(14A180031)

张弯弯(1992-)，女，河南洛阳人，在读硕士研究生，研究方向：分子遗传学。E-mail：m15565233893@163.com

*通讯作者：常重杰(1965-)，男，河南禹州人，教授，主要从事分子细胞遗传学研究。E-mail：changzhongjie@tom.com

S948

A

1004-3268(2016)09-0135-05