万兵兵,刘 晔,吴 越,刘世亮,王国文,张东艳,姜 瑛*(.河南农业大学 资源与环境学院,河南 郑州450002; 2.南京农业大学 资源与环境科学学院,江苏 南京20095; .山东省土壤肥料总站,山东 济南 25000)

烟草根际解磷解钾菌的筛选鉴定及应用效果研究

万兵兵1,2,刘 晔1,吴 越3,刘世亮1,王国文1,张东艳1,姜 瑛1*
(1.河南农业大学 资源与环境学院,河南 郑州450002; 2.南京农业大学 资源与环境科学学院,江苏 南京210095; 3.山东省土壤肥料总站,山东 济南 250100)

为了解决植烟区土壤及烟草磷、钾缺乏问题,从长势较好的烟草根际土壤中筛选解磷解钾菌株,并对其进行鉴定。结果表明,从长势较好的烟草根际土壤中筛选出一株高效解磷解钾菌株YC4,其对无机磷、难溶性钾的溶解量分别达到286.33、17.90 mg/L。经形态观察、生理生化特性测定及 16S rDNA序列分析确定该菌株为弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)。盆栽试验结果表明,接种该菌株的盆栽土壤有效磷、有效钾含量分别比未接种该菌株处理(对照)提高了6.81%、4.72%;接种菌株处理烟草根总长、根总表面积、根总体积和根尖总数分别较对照显著提高45.33%、55.96%、78.00%、28.30%,鲜质量约为对照的2倍,株高增幅达21.03%,干质量、SPAD值及植株的磷、钾含量分别较对照提高91.55%、14.03%、18.29%、29.57%。综上,该菌株可提高植烟区土壤有效磷、有效钾含量,促进烟草生长。

根际促生菌； 解磷解钾菌； 烟草生长

烟草是我国重要的经济作物,种植面积已超过130万hm2,居世界首位,主要分布在云南、山东、河南、甘肃、湖南等5个省份。其中，河南省的种植面积居全国第三,主要分布在许昌、南阳、周口和驻马店等地,是我国浓香型烟叶的代表[1-2]。烟叶除作为卷烟的原料之外,其所含的大量的天然化学物质,如烟碱、蛋白质、茄尼醇、尼古丁,都是优质的化工和医药原料[3]。

烟区土壤中磷、钾元素含量及供应情况对烟草的生长、产量及品质有很大的影响。河南省有83.22%的植烟区土壤有效磷含量低于20 mg/kg,64.83%的植烟区土壤有效钾含量低于150 mg/kg,有效养分的缺乏严重制约着烟草产业的发展[2,4-5]。提高土壤中有效养分含量是解决这一问题的主要途径,而长期、大量施用工业化肥会使有害物质残留量日趋增加,土壤微生态平衡失调,质量下降,同时会引发水体富营养化,对食品安全、人类健康及生态环境造成极大威胁[6]。因此,在当今大力发展生态农业的背景下,应减少农药和化肥的使用,采用生态方法促进土壤磷、钾的溶解,提高有效磷、有效钾含量[7-8]。而接种土壤中附生于植物根系的某些植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)能够活化土壤中的无效养分,促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用,是生态农业发展的有效途径之一[9-10]。

许昌市是河南省重要的烟叶产区，而该烟区土壤速效钾含量处于缺乏状态,有效磷含量也处于中等水平[11]。为此,本研究从许昌市烟草种植区选出一棵长势较好的烟草,采集其根际土壤,筛选根际菌,分离纯化能够溶解无机磷、难溶性钾的根际促生菌,进行液体摇瓶培养、烟草盆栽试验,以期解决植烟区土壤缺磷、缺钾问题。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试土壤 土壤为许昌植烟区的0～20 cm潮土,其基本养分含量如表1所示。

表1 供试土壤基本养分含量

1.1.2 培养基 LB培养基：蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g、琼脂 20 g、蒸馏水1 000 mL,pH 值7.0～7.2,121 ℃灭菌30 min[12]。

无机磷培养基：Ca3(PO4)25 g、葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、KCl 0.3 g、蒸馏水1 000 mL,pH 值7.0～7.2,121 ℃灭菌30 min[12]。

液态解钾细菌培养基：蔗糖10.0 g、酵母膏0.5 g、(NH4)2SO41.0 g、K2HPO4·3H2O 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCO31.0 g、钾长石粉1.0 g、蒸馏水1 000 mL, pH 值7.0～7.2,121 ℃灭菌30 min[12]。

若需要用固体培养基时,在以上配方基础上加琼脂20 g/L。

1.2 解磷解钾菌株的筛选

从许昌植烟区大田中选出一株长势较好的烟草,除去地上部分,将根部及根部土壤装入无菌袋中供分析。在实验室内,取该烟草样品根部1 mm范围内的根际土壤,悬浮于无菌水中,即成根际土壤悬浮液,按梯度稀释后,选择适当稀释度分别在LB固体培养基上涂平板 ( 每一梯度3～5皿 ),于 28 ℃ 恒温箱培养,根据菌落形态,挑选LB 平板上生长的单菌落,划线分离,4 ℃保存在平板上,备用[13-14]。

将分离纯化的菌株分别接种于盛有30 mL无机磷培养基的150 mL三角瓶中,放置于摇床中,于30 ℃ 180 r/min条件下培养。培养3 d后,培养液于10 000 r/min 离心10 min,取上清液,测定有效磷含量。

同时,将分离纯化的菌株分别接种于盛有30 mL液态解钾细菌培养基的150 mL三角瓶中,按照以上条件进行培养,培养液离心后测定有效钾含量。

1.3 菌株形态、生理生化及分子鉴定

菌株的形态鉴定: 将筛选的菌株接种到LB平板上,30 ℃培养24 h,观察菌落大小、形状、表面形态、边缘特征、隆起形状、透明度、湿润或干燥、光滑或粗糙、菌落及培养基的颜色等。

菌株生理生化指标鉴定：革兰氏染色、好氧性、接触酶、甲基红、乙酞甲基甲醇(V-P)、淀粉水解、明胶水解、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用等试验的方法均参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]和《伯杰细菌鉴定手册》[16]。

菌株分子鉴定: 将菌株用 LB 液体培养基培养至对数生长期,离心收集菌体,采用 SDS-CTAB法提取总基因组DNA,采用细菌16S rDNA通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行16S rDNA 的PCR 扩增。PCR 反应条件：94 ℃预变性30 s;94 ℃变性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35个循环;最后72 ℃延伸10 min。将PCR 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,然后切胶回收、纯化、测序(北京美亿美生物技术有限公司),根据获得的16S rDNA序列在GenBank中Blast 搜索同源序列,通过 MEGA 5.0 软件建立系统发育树[17]。并在NCBI上提交该菌株的分子序列,获得登录号。

1.4 解磷解钾菌的应用效果检测

将供试土壤剔除杂物,过2 mm筛,每个盆装700 g土壤,选出12棵长势较好、均匀一致的烟草苗,移栽于已装好供试土壤的盆中,注射无菌水,使盆栽土壤含水量达到田间持水量的(60± 2)%[18]。盆栽试验共设置以下2个处理。接菌处理(YC4)：向盆栽中喷洒10 mL解磷解钾菌菌液,接种量为108cfu/g,重复6次;对照(CK)：加入等量的无菌水,重复6次。培养30 d后取土壤样品和植株。取样前选择晴朗的天气在8：00—10：00用SPAD-502叶绿素仪活体测量中部叶片的SPAD值,每个叶片测定上(叶尖)、中(叶中部)和下(叶基)3个部位,每个部位测定3次,计算平均值。取样后,测定株高、鲜质量,然后经85 ℃杀青30 min 后, 在65 ℃条件下烘干,测定干质量,粉碎后过0.45 mm筛,经H2SO4-H2O2消化后,分别采用钼锑抗比色法、火焰光度计法测定植株磷、钾含量[19];并用根系扫描仪(LA1600+ scanner,Canada)扫描获得根系图像,用根系分析软件(Winrhizo2003b,Canada)分析获取根总长、根总面积、根总体积、根尖总数等二维形态参数;另外,分别采用0.5 mol/L NaHCO3溶液浸提—分光光度计法、2 mol/L HNO3溶液浸提—火焰光度法测定土壤有效磷、有效钾含量[19]。

2 结果与分析

2.1 烟草根际解磷解钾菌株的筛选及其对磷、钾的溶解效果

从烟草根际土壤中共分离纯化出9个菌株,分别标记为YC1～YC9。经过液体培养基摇瓶试验,结果表明,9个菌株解无机磷的能力差异较大(图1)。其中,菌株YC1、YC4、YC6和YC8对无机磷的溶解量达到140 mg/L以上,具有高效的解无机磷能力,显著高于其他菌株;进一步分析发现,YC4和YC6对无机磷的溶解量能够达到200 mg/L以上,显著高于其他菌株,尤其是YC4,对无机磷的溶解量最高,达286.33 mg/L,显著高于其他菌株。在菌株解钾能力复筛试验中,YC3、YC4、YC8、YC9菌株对难溶性钾盐的溶解能力较强,解钾量达到16 mg/L以上,显著高于其他菌株;尤其是菌株YC3,其解钾量最高,达到18.38 mg/L,高于YC4解钾量17.90 mg/L,但未达到显著水平。综合以上结果,YC4具有高效解磷解钾能力。

不同字母表示不同菌株间差异显著(P<0.05)图1 9个菌株对无机磷、难溶性钾的溶解效果

2.2 YC4菌株的菌落形态分析

经平板划线可见,YC4菌落呈米黄色,不透明,表面湿润且扁平,中央向上隆起,边缘光滑,不规则杆状排列,产芽孢(图2)。

图2 YC4菌株的菌落形态

2.3 YC4菌株的生理生化特性分析

经过革兰氏染色、好氧性、接触酶、甲基红、V-P、淀粉水解、明胶水解、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用试验(表2)发现,YC4菌株兼性厌氧,除柠檬酸盐利用项目显阴性外,其他测试项目均呈阳性。

表2 YC4菌株的生理生化特性

注：+为阳性 ;-为阴性。

2.4 YC4菌株的16S rDNA序列系统发育分析

利用Blast对YC4菌株16S rDNA序列进行同源性比对发现,菌株YC4与BacillusflexusIFO15715(AB021185)同源性为100%;构建菌株YC4的16S rDNA系统发育树(图3),并结合该菌株的生理生化特性,最终鉴定YC4菌株为弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus),在NCBI上提交菌株YC4的16S rDNA序列,并获得登录号为KP743125。

图3 YC4菌株16S rDNA基因序列的系统发育分析

2.5 YC4菌株的应用效果

2.5.1 接种YC4对土壤有效磷和速效钾含量的影响 由图4 可见,与对照相比,喷洒YC4菌液的盆栽土壤中有效磷、速效钾含量均有所增加,但差异未达到显著水平,其中有效磷含量提高了6.81%,速效钾含量提高了4.72%,说明筛选出的高效解磷解钾菌YC4能够促进土壤中无机磷、难溶性钾的溶解。

图4 接种YC4菌株对土壤有效磷和有效钾含量的影响

2.5.2 接种YC4对烟草根系形态和烟株生长的影响 土壤中的有效养分含量影响烟草根系的生长发育[20],特别是有效磷含量与烟草苗期的生长发育关系密切[21]。由表3可知,接种菌株YC4能够促进烟草根系的生长发育,与对照相比,喷洒菌液的烟草根系的总长度、总面积、总体积均极显著增加,增幅分别达到45.33%、55.96%、78.00%,根尖总数显著增加28.30%。

烟草苗期根系形态的良好建成是地上植株健壮生长的基础[22]。由表4可知,与对照相比,经YC4菌液喷洒的烟草植株鲜质量提高近1倍,株高和干质量也分别提高了21.03%和91.55%,差异均达到极显著水平;SPAD值增加14.03%,植株中磷含量增加18.29%,钾含量增加29.57%,差异均达到显著水平。SPAD值代表了叶片中叶绿素含量,光合作用是作物产量形成的基础, SPAD值的提高对作物产量的提升具有重要意义。烟草植株中磷、钾含量影响着烟叶的香味、可燃性及色泽,是评价烟叶化学成分和等级分类的重要指标。由此可见,喷洒YC4菌液能够大幅度提高烟草幼苗的鲜质量、干质量、株高、SPAD值以及磷、钾含量,为后期烟叶产量及品质的提高打下良好的基础。

表3 接种YC4菌株对烟草根系形态的影响

注：同列数据后*、**分别表示处理之间差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01),下同。

表4 接种YC4菌株对烟草植株生长的影响

3 结论

本试验从长势较好的烟草根际土壤中筛选分离出解磷解钾菌株YC4, 液体摇瓶试验结果表明,该菌株具有较强的解无机磷、难溶性钾的能力,溶解量分别高达286.33 mg/L 、17.90 mg/L。对该菌株的生理生化特性进行分析,并进行基因序列比对及系统发育分析,最终确定该菌株为弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)。盆栽试验结果表明,与对照相比,YC4菌液能够有效促进土壤中无机磷、难溶性钾的溶解,提高土壤中磷、钾的有效含量,促进烟草幼苗根系生长,使根变得更长,根尖数变多;提高烟草幼苗株高、干鲜质量、SPAD值及植株中磷、钾含量,为提高烟叶产量和改善烟叶品质奠定良好的基础,对农田中烟草的种植有实际指导意义。

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Screening,Identification of Phosphate- and Potassium-solubilizing PGPR and Its Promoting Effect on Tobacco

WAN Bingbing1,2,LIU Ye1,WU Yue3,LIU Shiliang1,WANG Guowen1,ZHANG Dongyan1,JIANG Ying1*
(1.College of Resources and Environment,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.College of Resources and Environmental Science,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095，China; 3.Soil and Fertilizer Station of Shandong Province,Ji’nan 250100，China)

Some phosphorus- and potassium-solubilizing PGPR strains were isolated from tobacco rhizosphere soil and identified to solve the problem of lack of phosphorus and potassium in tobacco planting soil.The results showed that YC4 strain isolated from tobacco rhizosphere soil could transform the hard-soluble phosphorus and potassium into the soluble nutrients,the transformation amounts of tricalcium phosphate and potassium silicate were 286.33 mg/L,17.90 mg/L respectively.YC4 strain was identified asBacillusflexusbased on morphological observation,physiological and biochemical characteristics test and 16S rDNA gene conserved sequence analysis.Pot experiment results showed that compared with the non-inoculated treatment(CK),the concentrations of available phosphorous and potassium of the treatment inoculated with YC4 significantly increased by 6.81%,4.72% respectively,which led to the root length,surface area,root volumes,root tips number of tobacco increased by 45.33%,55.96%,78.00% and 28.30%,respectively.With respect to plant morphological characteristics,the average wet weight was 2 times higher than the CK,and height of tobacco inoculated with YC4 significantly increased by 21.03%;the dry weight and SPAD value significantly increased by 91.55% and 14.03% respectively,and the total P and total K contents of tobacco significantly increased by 18.29% and 29.57%,respectively.Overall,YC4 strain could improve the contents of total P and total K in soil,promote the growth of tobacco.

PGPR; phosphate- and potassium-solubilizing strain; tobacco growth

2016-03-16

国家自然科学基金项目(41401274)；河南省烟草公司重点项目(HYKJ201215)；河南省教育厅项目(15A210012,14B210025)；河南省科技厅项目(162102410031)；郑州市民生进步科技工程项目(131PCXTD613)

万兵兵(1990-),男,河南商丘人,在读硕士研究生,研究方向：土壤生态学。E-mail：15136200211@163.com

*通讯作者：姜 瑛(1986-),女,河南信阳人,讲师,博士,主要从事土壤生态学研究。E-mail:JY27486@163.com

S154.39;S572

A

1004-3268(2016)09-0046-06