宾冬梅,黄河清涛,杨 灿,易 诚,伍渡清,饶力群

(1.衡阳师范学院 生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008；2.湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；3.燕京啤酒(衡阳)有限公司，湖南 衡阳 421008)

基于啤酒酵母二次发酵啤酒糟条件响应面优化研究

宾冬梅1,黄河清涛2,杨 灿1,易 诚1,伍渡清3,饶力群2

(1.衡阳师范学院 生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008；2.湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；3.燕京啤酒(衡阳)有限公司，湖南 衡阳 421008)

为提高发酵啤酒糟高蛋白产量，以一次发酵的黑曲霉和木霉双菌发酵的啤酒糟为原料，以粗蛋白含量为指标，以枯草芽孢杆菌分别与啤酒酵母配伍进行二次混菌发酵，并利用响应面进行分析优化，结果表明：啤酒酵母和枯草芽孢杆菌二次发酵啤酒糟对应的最佳条件为温度35 ℃，接种量16.26 %，酵母菌和枯草芽孢杆菌接种量比为5∶1，添加硫酸铵3.46 %，尿素添加量2 %，发酵时间4天，理论粗蛋白质含量38.11 %。

啤酒糟；混菌；二次发酵；响应面；高蛋白

啤酒糟是啤酒生产的残留物质，主要含有纤维素、淀粉及蛋白质[1]等，因含有大量水分则容易产生变质。目前啤酒企业绝大部分作为粗饲料销售，而因为纤维含量过高、适口性差，不能完全被养殖户接收[2-5]，很多企业当作废弃物处置，既浪费了资源，还污染了环境[6]。为了能够更高效利用啤酒糟，优选出产生纤维素酶的最佳发酵配伍方案，选定发酵菌种。

目前，国内外应用于生产纤维素酶的菌种主要有木霉、曲酶等[7-11]，全球纤维素酶市场中的20 %是来自曲霉属和木霉属[12]。本文以一次发酵的黑曲霉和木霉双菌发酵，以料水比为1∶0.5，黑曲霉比木霉接种量为5∶5的混菌接种20 %，32 ℃下培养3天的啤酒糟为原料，以粗蛋白含量为考察指标，使用啤酒酵母菌和枯草芽孢杆菌进行第二次混菌发酵，并通过响应面优化得到啤酒糟第二次发酵的最佳工艺，生产蛋白啤酒糟饲料，达到立体开发啤酒糟的目的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料

新鲜啤酒糟(燕京啤酒(衡阳)有限公司提供)

1.1.2 菌种

啤酒酵母NO.1(Sac-charomyces cerevisiae)和枯草芽孢杆菌NO.1(Bacillus subtilis)由湖南农业大学生科院实验室提供。

1.1.3 培养基

斜面(平板)培养基：麦芽汁琼脂培养基；种子培养基：酵母菌使用麦芽汁培养基，枯草芽孢杆菌使用牛肉膏蛋白胨培养基(1 L蒸馏水+20 g葡萄糖+15 g蛋白胨+5 g氯化钠+0.5 g牛肉膏+20 g琼脂)；发酵培养基：啤酒槽与麸皮的比例为8∶2。

1.1.4 实验试剂

硫酸铵、盐酸、氢氧化钠、蛋白胨、琼脂、硫酸铜、尿素、无水乙醇，均为分析纯。

1.1.5 仪器与设备

电热恒温水浴锅、电热恒温水槽、紫外-可见分光光度计、电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、电热恒温水浴锅、凯氏定氮仪、冷冻高速离心机、粗纤维测定仪、恒温培养摇床、超净工作台、光照培养箱、高压灭菌器等。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种培养

斜面孢子的培养：将菌株转接到新鲜的斜面试管，于30 ℃培养3 d。

种子制备：往250 mL三角瓶中倒入150 mL种子培养基，设置115 ℃灭菌16 min，等待冷却后接入新鲜成熟菌种斜面孢子一环，在摇床中30 ℃、150 r/min的条件下培养3 d。

发酵培养：取发酵培养基30 g加入到250 mL的烧杯中，在115 ℃灭菌15 min后，培养条件为含水量2倍，混菌接种20 %，其中黑曲霉比木霉接种量为6∶4，在30 ℃下培养3 d后，再接种一定量酵母菌和枯草芽孢杆菌，在一定温度下培养若干天。

1.2.2 蛋白质测定

粗蛋白含量的检测，使用饲料中粗蛋白的测定方法(GB/T 6432-94)

称0.5-1 g试样，放入到250 mL玻璃容器中，加入蒸馏水50 mL后，煮沸30 min。再加入10 %硫酸铜溶液和2.5 %氢氧化钠溶液各20 mL，并不停搅拌。静置2 h后定量滤纸过滤。沉淀用70 ℃的热水进行洗涤。最后沉淀在65 ℃烘干2 h。再把沉淀物放入到消化管中，加入混合催化剂6.4 g，硫酸12 mL，在420 ℃的消化炉上消化1 h。取出等待冷却后加入30 mL蒸馏水。

将带有消化液的管子插入蒸馏装置，其末端要浸入锥形瓶的吸收液内，吸收液用25 mL硼酸，加入2滴混合指示剂，消煮管中加入50 mL氢氧化钠溶液蒸馏至吸收液体积达到100 mL，取出锥形瓶，冷凝管末端的蒸馏水冲洗液需要流入锥形瓶内。

吸收液的滴定：0.1 mol/L的标准盐酸溶液滴定溶液由蓝绿色变为灰红色。

称0.5 g蔗糖代替试样进行空白测定，消耗滴定液(0.1 mol/L盐酸)的体积不能超过0.2 mL。

计算公式：

粗蛋白质

其中V2—滴定试样所需标准酸溶液体积，mL；V1—滴定空白所需标准酸溶液体积，mL；C—盐酸标准溶液浓度，mol/L；m—试样质量，g；V—试样分解液总体积，mL；V3—试样分解液蒸馏用体积，mL；0.0140—每毫克当量氮的克数；6.25—换算成蛋白质的平均系数。

1.2.3 响应面实验方法

Plackett-Burman设计：在前期试验的基础上，选择可能对发酵产物粗蛋白质产生的影响因素，包括菌种比、硫酸铵、时间、尿素、接种量、温度。为了对这6个因素进行全面考察，以粗蛋白质含量作为响应值Y，利用Plackett-Burman设计，察各因素的主效应和交互作用(见表1)。

表1 Plackett-Burman设计因素及水平

2 结果与分析

2.1 啤酒酵母的发酵条件优化

2.1.1 Plackett-Burman设计筛选主要的发酵影响因素

Plackett-Burman试验设计及结果见表2。

表2 Plackett-Burman试验方差分析结果

各因素系数估计和效应评价见表3。

表3 各因素影响的主效应分析

从表中可以看出，影响粗蛋白质含量的主要因子是温度、硫酸铵、接种量，三者在α=0.05水平上，P<0.05，表明对酿酒酵母和枯草芽孢杆菌混合发酵啤酒糟的粗蛋白质含量有显著影响(置信度>95%，)，其他因素在α=0.05水平上，P>0.05，表明对产物粗蛋白质含量影响不显著。所以以温度、硫酸铵、接种量进入下一步的响应面分析试验。

2.1.2 响应面分析

响应面分析：根据Box-Behnken的中心组合设计原理，对Plackett-Burman试验筛选的温度、硫酸铵、接种量3个主要影响因素进行Box-Behnken设计，以粗蛋白质含量为响应值，设计3因素3水平共15个试验点的响应面分析试验，各因素的取值水平见表4，试验结果见表5。

表4 主要影响因素及水平

表5 主要影响因素及水平

2.1.3 回归方程的方差分析

根据试验结果，利用 Minitab软件进行各因素回归拟合后得到回归方程，方差分析见表6。

表6 回归方程各项的方差分析

续表

来源自由度SeqSSAdjSSAdjMSFP温度*温度11.0306.0066.0061.110.340接种量*接种量1295.889301.602301.60255.850.001硫酸铵*硫酸铵17.9027.9027.9021.460.280交互作用327.07027.0709.0231.670.287温度*接种量18.2378.2378.2371.530.272温度*硫酸铵14.2034.2034.2030.780.418接种量*硫酸铵114.63114.63114.6312.710.161残差误差527.00227.0025.400失拟326.78626.7868.92982.960.012纯误差20.2150.2150.108合计14542.470

2.1.4 响应面直观分析

RSA方法的图形是接种量、硫酸铵量、温度对应特定的响应值Y构成的一个三维空间在二维面上的等高图，能够直观反映三因素对响应值的影响，从得到的应面分析图(图1)上可以找到接种量、硫酸铵量、温度在发酵过程中的相互作用，确认合适的工艺条件。

选用实验得到的最佳条件进行验证试验，3次平行试验得到的平均粗蛋白含量为37.46 %，与理论值相差小于1 %，说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性。其对应的最佳条件为温度35 ℃，接种量16.26 %，酵母菌和枯草芽孢杆菌接种量比为5∶1，添加硫酸铵3.46 %，尿素添加量2 %，发酵时间4 d，理论粗蛋白质含量38.11 %。

图1 接种量、硫酸铵添加量和温度对啤酒糟发酵产蛋白含量影响的响应面

2.5 各影响因素分析

2.5.1 发酵时间对产蛋白质的影响

在第二次发酵中，使培养基中蛋白质含量增高的是酵母菌的增殖，在前期发酵中，酵母菌以木霉、曲霉等一次发酵产生的还原糖类作为碳源，进行孢子的萌发、菌丝的生长；随着发酵的持续进行，培养基中木霉、曲霉等一次发酵产生的还原糖类逐渐减少，同时随着酵母菌体生物量逐渐增加，在发酵后期由于菌种的老化，反而会影响啤酒糟中的蛋白质含量。

2.5.2 菌液的接种量对产蛋白质的影响

显然，接种量会直接影响产酶结果，接种量过少，菌种生长达到稳定期的时间较长，糖原的消耗增加，后期供酵母发酵的糖原不足，导致生产效率低； 接种量过多，前期糖原消耗急剧增加，会导致后期营养物质供不应求。

2.5.3 温度对产蛋白质的影响

温度是微生物生长的最重要的影响因素之一。各种菌种都有其最相适宜的生长温度。在 0 ℃以下，菌体生长缓慢甚至处于休眠状态，温度过高可能使其生长繁殖受抑制甚至死亡。混菌发酵中存在多种菌种，每种菌生长发酵的适宜温度又不尽相同。选择合适的温度，使各菌种之间互相补充互相促进，既有利于代谢产物的大量累积，又不会影响微生物自身的生长代谢。但发酵温度过高，易造成杂菌的感染而影响发酵。

2.5.4 硫酸铵的添加量对产蛋白质的影响

微生物生长需要营养物质，主要的有碳源、氮源、无机盐、水分等。从实验来看，酵母菌以木霉、曲霉等一次发酵产生的还原糖类作为碳源，能满足酵母及枯草芽孢杆菌的孢子的萌发、菌丝的生长及发酵的需要，而氮原明显不足，因此添加的硫酸铵氮源对发酵具有显著的影响。

3 结 论

在以黑曲霉和木霉双菌一次发酵的啤酒糟中，添加啤酒酵母与枯草芽孢杆菌进行二次混菌发酵，并利用响应面进行发酵条件分析优化，结果表明：啤酒酵母和枯草芽孢杆菌二次发酵啤酒糟对应的最佳条件为温度35 ℃，接种量16.26 %，酵母菌和枯草芽孢杆菌接种量比为5∶1，添加硫酸铵3.46 %，尿素添加量2 %，发酵时间4 d，理论粗蛋白质含量38.11 %，表明通过二次混菌发酵能显著提高啤酒糟粗蛋白含量。

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(编校 陈志阳)

On Optimization of Second Fermentation of Brewer's Grains Through Response Surface Based onBeerYeast

BINDong-mei1,HUANGHe-qing-tao2,YANGCan1,YICheng1,WUDu-qing3,RAOLi-qun2

(1.College of Life Science and Environment,Hengyang Normal University,Hengyang Hunan 421008,China; 2.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha Hunan 410128,China;3.Yanjing(Hengyang) Beer Co.Ltd,Hengyang Hunan 421008,China)

In order to improve the output with high protein in Brewer's Grains with fermentation,take the Brewer's Grains as raw materials which through first fermentation withAspergillusandTrichoderma,the crude protein content as the index,secondary fermentation with mixedBacillussubtilisandBeerYeast,and optimized the craftwork with response surface analysis.Results show that: the secondary fermentation withbeeryeastandBacillussubtilisin optimum conditions which temperature was 35 ℃,inoculum was 16.26 %,beeryeastandBacillussubtilisinoculation ratio was 5:1,ammonium sulfate was 3.46 %,urea content was 2 %,fermentation time was 4 days,the theory crude protein content was 38.11 %.

brewer's grains; mixed microorganism; secondary fermentation; response surface analysis; high protein

2016-10-09

湖南省自然科学基金省市联合基金(14JJ5001)

宾冬梅(1970-)，教授，硕士生导师，研究方向：农副产品开发与利用。

Q936

A

1673-0313(2016)06-0101-05