江连洲，曹飞扬，陈颖，王娉，赵晓美

（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030；2.中国检验检疫科学研究院农产品安全研究中心，北京 100176）

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱快速鉴定蜡样芽胞杆菌研究与应用

江连洲1，曹飞扬1，陈颖2，王娉2，赵晓美2

（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030；2.中国检验检疫科学研究院农产品安全研究中心，北京 100176）

建立基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术针对食源性蜡样芽胞杆菌快速鉴定方法。以蜡样芽胞杆菌模式菌株为研究对象，优化该菌样品处理方法，并选取17株蜡样芽胞杆菌标准菌株补充MALDI-TOF-MS数据库，探讨方法灵敏度、稳定性和准确性。结果表明，蜡样芽胞杆菌最佳样品处理方法是甲酸提取法，数据库补充可提高该菌鉴定可信度，MALDI-TOF-MS鉴定方法准确度高、稳定性好，灵敏度为104cfu并通过聚类分析分型。研究确定的MALDI-TOF-MS鉴定方法准确快速，可为食源性蜡样芽胞杆菌快速鉴定和分型提供技术支持。

蜡样芽胞杆菌；MALDI-TOF-MS；鉴定；快速；准确

蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是革兰氏阳性菌，为芽胞杆菌属，兼性需氧。蜡样芽胞杆菌在水、空气、土壤中广泛存在，食品中易检出[1-4]。感染该菌后可导致胃肠功能紊乱、各种局部或全身性感染，如坏死性肠炎、肝功能衰竭、菌血症和脑膜炎[5-8]。

目前，蜡样芽胞杆菌鉴定以传统生化鉴定为主，该方法操作繁琐、耗时长、鉴定结果滞后[9]，分子鉴定方法有PCR、环介导等温扩增、16S rRNA测序技术等[10-13]。但PCR鉴定方法无统一目的基因，不易实现标准化[14]；环介导等温扩增技术灵敏度较高，易被污染，产生假阳性结果；16S rRNA测序技术难以实现蜡样芽胞杆菌群内种间区分。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionisation time of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）为基于细菌蛋白质（2～20 ku）菌种鉴定方法，将一定比例微生物样品和基质溶液点样到靶板上，溶剂挥发后激光轰击，基质吸收能量后转移到微生物样品解吸，通过飞行时间检测器分离质荷比（m/z）不同的离子，采集质谱图与数据库比对获得鉴定结果[15]。MALDI-TOF-MS方法具有操作简单、快速、高通量、准确度高等优点，适合病原微生物诊断和监测。但MALDITOF-MS鉴定结果受样品处理方法、数据库完善程度等因素影响，为保证鉴定结果准确度，需优化影响因素[16-18]。Matsuda等研究临床葡萄球菌MALDITOF-MS菌种鉴定方法，发现样品制备方法是影响蛋白图谱重要因素，不同样品制备方法差异显著（P＜0.05）[19]；陈秀金等以沙门氏菌为研究对象，探究不同样品处理方法对MALDI-TOF-MS鉴定结果影响，发现不同样品处理方法对蛋白指纹图谱影响较大[20]。

本文通过蜡样芽胞杆菌样品处理方法优化及数据库补充，建立蜡样芽胞杆菌MALDI-TOF-MS鉴定方法，确定该方法灵敏度及稳定性，比较生化鉴定结果，以期为蜡样芽胞杆菌准确快速鉴定和分型提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

试验菌株为17株国际通用蜡样芽胞杆菌标准菌株，编号分别为ATCC10702、ATCC10987、 ATCC11950、ATCC12826、ATCC13061、ATCC14579、ATCC14737、ATCC15816、ATCC19637、ATCC21769、ATCC21772、ATCC27348、ATCC27877、ATCC33018、ATCC33019、ATCC49063、ATCC49064，购自美国模式菌种收集中心（ATCC）。

1.2 食品样品

大块腐乳、玫瑰腐乳、白腐乳等腐乳样品购自北京华联超市，涵盖4个品牌。

1.3 主要试剂与仪器

脑心浸液肉汤（Brain heart infusion,BHI）、营养琼脂（Nutrient agar,NA）、脑心浸液琼脂（Brain Heart infusion agar,BHIA）、胰酪胨大豆多粘菌素肉汤、甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂购自北京陆桥技术股份有限公司；三氟乙酸（Trifluoracetic acid,TFA）（色谱纯）购自德国Merck公司；无水乙醇（色谱纯）、甲酸（Formicacid,FA）、乙腈（Acetonitrile,ACN）购自美国Fisher公司；基质α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-Cyano-4-Hydroxy-Cinnamic Acid，HCCA）、肽蛋白标准品购自德国Bruker公司；基质和标准品配制溶剂（50%ACN，2.5%TFA，47.5%水）；台式冷冻离心机（德国Sorvall公司）；PhoenixTM-100全自动微生物鉴定/药敏系统（美国BD公司）；AutoflexIII生物质谱仪（德国Bruker公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌株培养

待鉴定蜡样芽胞杆菌接种BHIA培养基，30℃培养24 h。

1.4.2 样品处理方法选择

采用直接转移法、扩展直接转移法、甲酸提取法三种样品处理方法处理蜡样芽胞杆菌模式菌株ATCC14579培养物，探讨不同样品处理方法对鉴定结果影响。直接转移法将蜡样芽胞杆菌模式菌株ATCC14579单菌落在靶板靶点上涂布成一个薄层，覆盖1 μL HCCA溶液并自然晾干。扩展直接转移法将蜡样芽胞杆菌模式菌株ATCC 14579单菌落在靶板靶点上涂布成一个薄层，覆盖1 μL 70%甲酸溶液并自然晾干，再覆盖1 μL HCCA溶液并自然晾干。甲酸提取法在离心管中加入300 μL去离子水，取蜡样芽胞杆菌模式菌株ATCC 14579单菌落至离心管中并充分混匀，加入900 μL无水乙醇充分混匀，13 000 r·min-1离心2 min并弃上清，再次离心并用移液器弃上清液，室温干燥3 min，加入30 μL 70%甲酸溶液并用移液器吸放混匀，加入30 μL纯乙腈并用移液器吸放混匀，13 000 r·min-1离心2 min，取1 μL上清点样至靶板靶点并自然晾干，覆盖1 μL HCCA溶液并自然晾干。选取可信度分数高、蛋白质峰多、峰强度高、谱图基线平滑、信噪比高处理方法为最佳。

1.4.3 MALDI-TOF-MS数据采集及结果判定

肽蛋白标准品溶液对仪器校准后，运用Flex Control软件采集样品数据（仪器参数：Smartbeam激光器；激光频率200 Hz；每个样品谱图累积200个激光脉冲信号；质量为2～20 ku），获得样品质谱图谱；BioTyper软件将采集样品图谱与数据库中标准图谱比对，根据得分判定结果。得分2.300～3.000表示菌种鉴定可信度较高，2.000～2.299表示保守菌属鉴定或可能菌种鉴定，1.700～1.999表示可能菌属鉴定，0.000～1.699表示鉴定结果不可信。

1.4.4 MALDI-TOF-MS数据库补充及识别能力验证

以17株国际通用蜡样芽胞杆菌标准菌株为试验对象，采用最佳样品处理方法补充蜡样芽胞杆菌数据库（原数据库中仅2株蜡样芽胞杆菌质谱数据）。每株标准菌株重复点样8次，每个靶点采集3张质谱图，使用FlexAnalysis软件分析获得24张质谱图，除去低质量图谱，运用BioTyper软件将＞20张有效图谱（若＜20张，重复试验）添加到数据库中。依据GB 4789.14-2014[21]，选择不同品牌、不同批次腐乳样品通过样品处理、胰酪胨大豆多粘菌素肉汤选择性培养、显色培养基MYP分离纯化等分离蜡样芽胞杆菌，MALDI-TOF-MS对分离41株蜡样芽胞杆菌疑似菌株（编号为0001～0041）采集数据，分别与数据库补充前后标准图谱比对。

1.4.5 生化鉴定

以BD全自动生化鉴定系统鉴定腐乳中分离的41株蜡样芽胞杆菌疑似菌株，并与MALDI-TOFMS数据库补充后鉴定结果比较。

1.4.6 MALDI-TOF-MS鉴定灵敏度及稳定性试验

生理盐水将蜡样芽胞杆菌模式菌株ATCC 14579分别稀释为108～100cfu·mL-1菌液，取1 mL菌液12 000 r·min-1离心2 min，弃上清，最佳样品处理方法沉淀菌体，MALDI-TOF-MS鉴定，分析不同数量蜡样芽胞杆菌ATCC14579鉴定结果，测定MALDI-TOF-MS鉴定灵敏度。

将蜡样芽胞杆菌模式菌株ATCC14579在30℃培养24 h条件下传代培养3次，每次传代后均取3个单菌落用最佳样品处理方法处理，MALDITOF-MS鉴定以比较同批次及不同批次MALDITOF-MS鉴定一致性。

1.4.7 MALDI-TOF-MS分型

运用BioTyper软件对1.4.4中41株蜡样芽胞杆菌分离株质谱数据聚类，分析蜡样芽胞杆菌分离株型与来源关系。

2 结果与分析

2.1 样品处理方法选择

不同样品处理方法影响MALDI-TOF-MS鉴定结果，选择适合菌株鉴定样品处理方法是保证MALDI-TOF-MS鉴定准确前提。三种样品处理方法下蜡样芽胞杆菌ATCC14579可信度得分均在2.300以上，说明鉴定结果可靠。与其他两种样品处理方法相比，甲酸提取法可信度得分最高、蛋白峰最多（见表1），蛋白指纹图谱基线平滑、峰强度高（见图1），信噪比高，统计学分析结果表明，甲酸提取法与其他两种样品处理方法可信度得分、蛋白峰数量差异显著。因此选取甲酸提取法为最佳样品处理方法。

表1 不同处理方法下MALDI-TOF-MS鉴定结果Table 1 Detection results of different pre-treatments by MALDI-TOF-MS

图1 不同处理方法对蜡样芽胞杆菌蛋白指纹图谱影响Fig.1 Effect of different pre-treatments on protein mass spectrometric profiles ofBacillus cereus

2.2 MALDI-TOF-MS数据库补充及识别能力验证

微生物通过MALDI-TOF-MS采集数据后，需与标准数据库比对获得鉴定结果，因此MALDITOF-MS菌种鉴定数据库对鉴定结果尤为重要。本研究运用MALDI-TOF-MS采集17株国际通用蜡样芽胞杆菌标准菌株数据，筛去低质量谱图，通过BioTyper软件将有效谱图添加到细菌鉴定数据库。本研究共采集21张ATCC10702有效谱图（见图2）。

其他图谱为22张ATCC10987有效谱图、22张ATCC11950有效谱图、23张ATCC12826有效谱图、24张ATCC13061有效谱图、23张ATCC14579有效谱图、22张ATCC14737有效谱图、24张ATCC15816有效谱图、24张ATCC19637有效谱图、23张ATCC21769有效谱图、23张ATCC21772有效谱图、24张ATCC27348有效谱图、23张ATCC27877有效谱图、24张ATCC33018有效谱图、23张ATCC33019有效谱图、24张ATCC49063有效谱图、20张ATCC49064有效谱图。

通过比较数据库补充前后MALDI-TOF-MS鉴定结果（见表2），可知41株蜡样芽胞杆菌分离菌株在数据库补充前可信度得分较低，部分菌株得分在2.300以下；数据库补充后，其中39株蜡样芽胞杆菌可信度得分提高，所有菌株鉴定得分均在2.300以上，识别能力提高34.15%（可信度得分在2.300以上菌株增加量/总菌株数），由差异显著性分析发现，蜡样芽胞杆菌数据库补充前后鉴定结果差异显著（P＜0.05），说明MALDI-TOF-MS数据库补充提高菌种鉴定可信度。

综合上述试验结果，最优样品处理方法为甲酸提取法，数据库补充提高蜡样芽胞杆菌鉴定可信度。在此条件下，蜡样芽胞杆菌MALDI-TOF-MS鉴定结果可信度高，且10 min内可得到鉴定结果。

2.3 与生化鉴定比较

通过比较41株蜡样芽胞杆菌疑似菌株MALDITOF-MS鉴定结果和生化鉴定结果，探究MALDITOF-MS鉴定准确性。结果表明，MALDI-TOF-MS鉴定结果与生化鉴定结果一致，均鉴定为蜡样芽胞杆菌（见表2），MALDI-TOF-MS鉴定周期显著低于传统生化鉴定。说明本研究建立蜡样芽胞杆菌MALDI-TOF-MS鉴定方法准确度高，可用于蜡样芽胞杆菌快速、准确鉴定。

2.4 MALDI-TOF-MS鉴定方法灵敏度

运用MALDI-TOF-MS鉴定方法鉴定108～100cfu蜡样芽胞杆菌ATCC14579，探讨MALDI-TOF-MS鉴定灵敏度。结果表明，蜡样芽胞杆菌ATCC 14579数量为108～104cfu时，可信度得分均＞2.000，鉴定结果准确；在103～100cfu范围内时，可信度得分＜1.700，无准确鉴定结果（见表3）。

本研究MALDI-TOF-MS鉴定灵敏度为104cfu，可满足蜡样芽胞杆菌在琼脂培养基上增菌培养后鉴定需求。

2.5 MALDI-TOF-MS鉴定方法稳定性

通过对比蜡样芽胞杆菌ATCC14579同一传代次数不同菌落及不同传代次数鉴定结果，探讨MALDITOF-MS鉴定稳定性。

由表4可知，蜡样芽胞杆菌ATCC14579同一传代次数3个菌落平行样可信度得分接近，差异显著性分析发现，不同传代次数蜡样芽胞杆菌ATCC14579可信度得分差异不显著（P＞0.05），说明蜡样芽胞杆菌MALDI-TOF-MS鉴定方法稳定性较好，同批次及不同批次鉴定结果一致。

图2 蜡样芽胞杆菌ATCC10702平行蛋白指纹Fig.2 Protein mass spectrometric profiles ofBacillus cereusATCC10702

2.6 MALDI-TOF-MS分型结果

通过运用MALDI-TOF-MS对蜡样芽胞杆菌分型，探讨不同品牌腐乳蜡样芽胞杆菌亲缘关系。分型结果表明，以距离0.87为界分型，可将41株蜡样芽胞杆菌分为4个型别，A型包含14株蜡样芽胞杆菌分离株，源于3个品牌腐乳样品；B型包含11株蜡样芽胞杆菌分离株，源于2个品牌腐乳样品；C型包含7株蜡样芽胞杆菌分离株，源于1个品牌腐乳样品；D型包含9株蜡样芽胞杆菌分离株，源于2个品牌腐乳样品（见图3）。

同一品牌腐乳中分离蜡样芽胞杆菌具有聚集性，品牌3和品牌4中分离蜡样芽胞杆菌分别聚集到D型和A型，C型中7株蜡样芽胞杆菌均源于品牌1，为蜡样芽胞杆菌溯源提供参考。但并非所有相同品牌腐乳中蜡样芽胞杆菌均可聚到同类，说明某些品牌腐乳中分离蜡样芽胞杆菌呈多样化，这与原材料、生产设备、生产人员等因素密

切相关。

表2 41株分离菌株MALDI-TOF-MS与BD鉴定结果Table 2 Detection results of 25 strains of isolates by MALDI-TOF-MS and BD

表3 灵敏度试验结果Table 3 Results of the identification sensitivity

表4 稳定性试验结果Table 4 Results of the identification stability

图3 41株蜡样芽胞杆菌聚类分析Fig.3 Cluster analysis diagram for 41 strains of Bacillus cereus

3 讨论与结论

本研究比较不同样品处理方法对蜡样芽胞杆菌MALDI-TOF-MS鉴定结果影响，结果发现不同处理方法鉴定结果差异显著。同种/属细菌，选择不同样品处理方法影响MALDI-TOF-MS鉴定结果准确性，优化和统一样品处理方法是保证MALDI-TOF-MS准确鉴定前提。数据库完善程度是制约MALDI-TOF-MS鉴定准确性重要因素，本研究选取17株国际通用蜡样芽胞杆菌标准菌株补充数据库，提高蜡样芽胞杆菌鉴定可信度，与战晓微等研究结果一致[22]。MALDI-TOF-MS数据库补充时效性是限制该技术发展重要因素，保证标准菌株及时补充数据库，才能发挥MALDI-TOF-MS菌种鉴定优势。本研究建立蜡样芽胞杆菌MALDITOF-MS鉴定方法灵敏度为104cfu，可满足蜡样芽胞杆菌鉴定需要，良好稳定性可为蜡样芽胞杆菌指纹图谱聚类分析及快速溯源奠定基础。与生化鉴定比较发现，MALDI-TOF-MS鉴定结果与生化鉴定结果一致，说明MALDI-TOF-MS鉴定方法适用蜡样芽胞杆菌检测和鉴定，也为其他病原菌快速鉴定提供参考。通过聚类分析将41株蜡样芽胞杆菌分离株分型，分型结果显示菌株型别与来源具有相关性，说明其在蜡样芽胞杆菌溯源方面具有参考价值。质谱数据准确是保证MALDI-TOFMS分型结果可靠前提，优化和统一MALDI-TOFMS数据采集影响因素是保证分型结果准确关键。

综上所述，本研究通过优化蜡样芽胞杆菌样品处理方法及数据库补充，实现蜡样芽胞杆菌快速准确鉴定。研究MALDI-TOF-MS鉴定方法，可为预防和鉴别蜡样芽胞杆菌提供技术手段，应用前景广阔。

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Study on matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry method forBacillus cereusidentification/

JIANG Lianzhou1,CAO Feiyang1,CHEN Ying2,WANG Ping2,ZHAO Xiaomei2(1.School of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Agro-product Safety Research Center,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100176,China)

Identification method forBacillus cereusin food by matrix assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)was established.This study optimized sample handling methods,focusing onBacillus cereustype strain,and 17 standard strains ofBacillus cereuswere used to supplement a MALDI-TOF-MS database,the sensitivity,stability,accuracy of the method were evaluated.The results showed that the optimal sample handling method ofBacillus cereuswas formic acid treatment method,the credibility of identification results ofBacillus cereuswas improved by supplementing the database.Based on these conditions,the MALDI-TOF-MS method showed excellent accuracy,stability and appropriate sensitivity(104cfu).Further typing was achieved by cluster analysis.The identification method forBacillus cereusby MALDI-TOF-MS is accurate,rapid,and it could provide a technical support for identification and typing ofBacillus cereusin food.

Bacillus cereus;MALDI-TOF-MS;identification;rapid;accurate

TS207.4

A

1005-9369（2016）12-0056-09

时间2016-12-28 10:33:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161228.1033.004.htmll

2016-10-03

国家科技支撑计划项目（2014BAD04B03）

江连洲（1960-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:jlzname@163.com

江连洲,曹飞扬,陈颖,等.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱快速鉴定蜡样芽胞杆菌研究与应用[J].东北农业大学学报, 2016,47(12):56-64.

Jiang Lianzhou,Cao Feiyang,Cheng Ying,et al.Study on matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry method forBacillus cereusidentification[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(12):56-64. (in Chinese with English abstract)