杨贞妮 杨桂清

(沈阳感光化工研究院有限公司 辽宁 沈阳 110141)

一种高效纯化辅酶Q10的新工艺

杨贞妮 杨桂清

(沈阳感光化工研究院有限公司 辽宁 沈阳 110141)

通过两次重结晶和一次硅胶柱层析纯化精制辅酶Q10粗品，产品纯度达到99.0％以上。实验讨论了柱层析中高径比、洗脱液的种类、配比对提纯的影响；结果表明，最佳条件为高径比为1.5:1、正己烷:异丙醚为7:1，得到的产品纯度为99.3％，有望用于工业上。

辅酶Q10；纯化精制；硅胶柱层析

1 引言

辅酶Q10（Coenzyme Q10）纯品为黄色或橘黄色的晶体，熔点为48.0-52.0℃，易溶于正己烷、苯、氯仿，微溶于乙醇，不溶于水和甲醇等强极性有机溶剂，对光不稳定易分解为微红色的物质，对湿度和温度不敏感，较稳定。辅酶Q10可存在牛肉、豆油、花生、鲭鱼等食物及动物的肝、肾组织中[1]。

辅酶Q10具有自由基清除、改善细胞内呼吸、保护线粒体及增强免疫等功能。因此，辅酶Q10在医药和化妆品等行业有着广泛而重要的应用。可用于心脏病、高血压、子痫、帕金森及酒精肝等疾病的辅助治疗[2-6]；添加到化妆品中，淡化细纹，细腻肌肤，起到美容养颜的效果。因此，辅酶Q10深受广大消费者的青睐[7]。

辅酶Q10的生产多采用微生物发酵法，生产产量高。因此制约辅酶Q10工业化的主要因素是下游提取纯化工艺。现行的辅酶Q10的提纯方法有∶活性氧化铝柱层析、硅胶柱层析及大孔吸附树脂法。这些方法存在以下问题∶活性氧化铝价格较高使其工业化应用成本上升；硅胶柱层析次数较多且硅胶重复利用率低，导致工业操作复杂，使后续成本增加。大孔吸附树脂法较为先进，目前仅适合处于实验室小试阶段。

本文以纯度为50％-60％的辅酶Q10粗提物（外标法测）为原料，通过两次重结晶和一次硅胶柱层析精制后，产品纯度达到99％以上；探讨了柱层析过程中洗脱液的种类、配比等条件对提纯效果的影响。

2 实验

2.1 材料与仪器

正丁醇（AR）正己烷（AR）异丙醚（AR）400目层析硅胶（青岛海洋化工有限公司）Q10粗品；纯度为50％-60％的Q10粗品由神州生物科技有限公司提供。

Agilent 1100 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；层析柱φ5 cm× 20cm（玻璃）；

2.2 HPLC检验方法

色谱柱∶SB-C18; φ4.6mm×150mm（Agilent公司生产）；检测波长275nm；柱温∶30℃；流动相∶甲醇∶乙醇=65∶35（V/V）；流速∶1mL/ min；进样∶2μL；停止时间∶18min；Q10的保留时间∶14min。

分析方法∶在上述的色谱条件下,依次进Q10标准品、样品的接收液各2μL，平行进样两次，用外标法进行定量。

2.3 辅酶Q10粗品的纯化

2.3.1 重结晶提纯粗品

称取20g含量为57％的Q10粗品（外标法测定）置于250ml四口瓶中，加入一定量的正丁醇，慢搅拌加热至45℃，固体全部溶解，然后加入少量晶种降温使其慢慢析出晶体；当温度自然降至24℃-25℃时有晶体析出，自然放置一夜后干燥即可得到Q10一晶。利用同样的方法，提纯Q10一晶得到Q10二晶，纯度为95％左右。

2.3.2 硅胶柱层析提纯辅酶Q10二晶

1) 称取硅胶45g，将其装入直径为5cm的玻璃柱中，压实后放置一宿自然沉降后柱高为7.5cm，次日上样。

2) 采用湿法上样。将5gQ10二晶样品（纯度为95％）置于少量展开剂中，利用磁力搅拌器使其充分溶解；样品溶解后，再用胶头滴管将溶液沿着层析柱内壁慢慢加入。

3) 采用正己烷∶异丙醚为7∶1的混合溶液洗脱辅酶Q10，控制流出液的流速为90d/min，每15 mL接收一次流出的洗脱液；根据薄层检验结果分段合并流出液，然后将其干燥，取出Q10粉体待测。

4) 对通过硅胶柱层析分离过的辅酶Q10流份进行液相色谱分析（归一化百分率法），即得99％以上的纯品。将其中杂质含量与二晶样品杂质含量对比，发现保留时间为9.00min的杂质大幅度减少；保留时间为10.11min和11.58min杂质完全消失，特别是11.58min杂质与12.30minQ10极性特别相近，重结晶方法无法除去，利用硅胶柱层析可以完全除去，因而使样品纯度大大提高。

2.3.3 洗脱液的种类对提纯的影响

取400目硅胶（处理过的）3份，每份45g，分别装入3个尺寸相同的层析柱中，用不同种类的洗脱液对同一纯度的Q10二晶样品进行纯化，将所得的样品烘干后利用HPLC测纯度（外标法），并计算样品收率。结果见表1。

2.3.4 洗脱液的配比对提纯的影响

取400目硅胶（处理过的）4份，每份45g，分别装入4个尺寸相同的层析柱中，用不同配比的洗脱液对同一纯度Q10二晶样品进行纯化，将所得的样品烘干后利用HPLC测纯度（外标法），并计算样品收率。结果见表2。

表2 不同配比洗脱液下的辅酶Q10提纯情况Purification of Coenzyme Q10in differentproportion of the elution liquid

2.3.5 不同高径比对提纯的影响

取400目硅胶(处理过的)5份，每份45g，分别装入5个直径不同的层析柱中，装实层析柱后测量柱子的高度，计算出柱子的高径比；用配比为7∶1的洗脱液对同一纯度Q10二晶样品进行提纯，测量样品的纯度（外标法），并计算洗脱液消耗量及样品收率。结果见表3。

表3 不同高径比下的辅酶Q10提纯情况Purification of Coenzyme Q10in differentheight-diameter ratio

3 结果与讨论

3.1 洗脱液的选择

我们采用了不同种类的溶剂配成洗脱液对样品进行提纯，根据表1的结果可看出正己烷和异丙醚混合作为洗脱液的提纯效果明显优于其它两种洗脱液，可以将Q10纯度从95％提高至99.3％，样品重量收率为82％，均为三种洗脱液中最高。因此，洗脱液的最佳选择为正己烷和异丙醚混合。

3.2 洗脱液配比对分离效果的影响

我们采用了不同极性的洗脱液对样品进行分离，根据表2的结果可得出，洗脱液的最佳配比为正己烷∶异丙醚=7∶1（V/V）。洗脱液极性过大或过小都不利于分离，使过多的杂质与辅酶Q10共流出，降低了辅酶Q10的纯度。

3.3 柱高径比对分离效果的影响

我们选择了5种不同高径比的层析柱对样品进行提纯，根据表3的结果可得出，当高径比为1.5∶1时，洗脱液的用量大大降低了，单耗为182ml/g，同时样品的纯度和收率均为最高，分别为99.19％和89％。因此，柱高与柱径的最佳比为1.5∶1，可以大大节约洗脱液的消耗，利于该工艺工业化时降低能耗，节约成本。

4 结论

硅胶柱层析方法可以将辅酶Q10二晶样品进一步提纯，达到99％以上。洗脱液选用正己烷与异丙醚混合，最佳配比为7∶1，层析柱高径比最佳为1.5∶1，可以将样品提纯到99％以上，样品的提纯效果最佳，同时又降低了洗脱液的消耗。本文总工艺为两次重结晶和一次硅胶柱层析提纯辅酶Q10粗品，所得产品纯度较高，工艺操作简便，硅胶使用量小，有利于环保，适合于工业化。

[1]张鸿，吴玉荷。148类维生素物质——辅酶Q10的研究进展[J]。国外医学卫生学分册，2002，29(6): 370-373.

[2]G. F. Watts, D. A. Playford ,K. D. Croft.A Coenzyme Q10improves endothelial dysfunction of the brachial artery in type Ⅱdiabetes mellitus[J].Diabetologia，2002，45(3)420-426.

[3]刘文利。辅酶Q10治疗冠心病心绞痛疗效观察[J]。中华现代医药科技，2003，3(2)；25-25.

[4]赵春玉，赵宝东，王雅君。CoQ10在帕金森治疗中的应用[J]。中华神经科杂志，2003，36（4）:315-319.

[5]杨欣璐，孙敬霞，蔡丽瑛。辅酶Q10对子痫前期中氧化应激的防治作用的研究进展[J]。现代生物医学进展，2012(24)，4765-4768.

[6]张军，王萌,赵锐。辅酶Q10联合还原型谷胱甘肽治疗酒精性肝病临床分析[J]。中国医药指南，2010，8(35)，30-31.

[7]叶青，张宾红，关屹。辅酶Q10的性质及其在化妆品中的应用[J]。1999(3)，32-34.

AEfficientPurification Process of Coenzyme Q10YANG Zhen-ni YANG Gui-qing

(Shenyang and research institute of the photographic materials & chemical industry,Shenyang 110141China)

Coenzyme Q10 crude product was purified by two recrystallization and a silica gel chromatography，product purity was more than 99.0 ％.Height-diameter radio、eluent species and ratio were discussed for the impact on the purification by testing; The results showed the optimum condition were height-diameter radio of 1.5:1、n-hexane: isopropyl ether of 7:1，the purity of product was 99.3％，It is expected to be used in industry.

Coenzyme Q10; Purification; Silica gel chromatography

TQ46

A

1009-5624-（2016）01-0029-03