张毅，牛德强，严涛，陈珂可，朱建国，夏九学*

（1.山东省工业和信息化研究院，山东 济南 250013；2.山东亚奥特乳业有限公司，山东 泰安 271000；3.微康益生菌（苏州）股份有限公司，江苏 苏州 215200）

乳酸菌作为一种益生菌，可产生多种代谢产物，如乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、细菌素、胞外多糖、不饱和脂肪酸、B族维生素等[1-3]。其中蛋白质类抑菌代谢产物主要为细菌素，它是由某些乳酸菌在生长过程中经过代谢产生的一类具有抑菌作用的蛋白质或多肽类物质，具有可抑制腐败菌和致病菌生长的能力[4-7]，可广泛应用于乳制品发酵、泡菜腌制、肉制品加工、乳酸菌饮料生产以及畜牧养殖（如饲料、青贮）等领域[8-12]。目前乳酸菌在发酵生长过程中代谢所产生的细菌素，引起了国内外学者的广泛研究[13-15]。

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一种发酵过程中产芽孢的乳酸菌[16]，是目前国内唯一一个收录于食品名单目录的芽孢杆菌[17]。研究表明，凝结芽孢杆菌代谢产物除了乳酸，还有有机酸（乙酸等）、不饱和脂肪酸等物质[16，18]，但是目前对凝结芽孢杆菌的抑菌物质（除有机酸以外的物质）的研究鲜有报道[19]。本研究从传统发酵食品中分离、筛选及鉴定，得到一株凝结芽孢杆菌 BC99（Bacillus coagulans BC99），除了具有一般乳酸菌应有的益生菌功能性能，还具有抗逆性强（耐酸、耐胆盐、耐高温）等芽孢杆菌的特性[17]，弥补了一般乳酸杆菌抗逆性、耐受性的不足。本研究对凝结芽孢杆菌BC99的代谢产物的抑菌性能进行初步研究，排除一些酸性代谢物质（乳酸、乙酸等）、过氧化氢等对抑菌效果的影响，并对其代谢产物抑菌物质进行初步的判断，为后续的应用（如食品、保健食品、畜牧、饲料、水产等）及研究开发提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

凝结芽孢杆菌BC99：微康益生菌（苏州）股份有限公司，分离筛选自泡菜中；大肠埃希菌（Escherichia coli CVCC 1527）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium CVCC 2228）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CVCC 4098）、猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis CVCC 503）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis CAU 0805）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens CVCC 46）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella CVCC 1676）：中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 主要试剂

平板计数琼脂（plate count agar，PCA）固体培养基、营养肉汤培养基、MRS培养基：青岛海博生物技术有限公司；胃蛋白酶（2 500 U/mg）、胰蛋白酶（2 500 U/mg）、蛋白酶 K（30 U/mg）、过氧化氢酶（3 000 U/mg）：美国Sigma公司；盐酸：西陇科学股份有限公司；氢氧化钠、乳酸：国药集团化学试剂有限公司；以上所有化学试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器和设备

DHP-200恒温培养箱：金坛市白塔新宝仪器厂；IS-RDD3迥旋式恒温摇床：广州市深华生物技术有限公司；PHS-3E型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SW-CT-2FD双人超净工作台：苏州净化设备有限公司；GL-12M高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；LDZX-75KBS立式高压蒸汽灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；BAS 124S电子分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；DHG-9246A电热鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；Thermo 902超低温冰箱：美国Thermo公司；HH-6J数显恒温水浴锅：金坛市友联仪器研究所；902型-80℃超低温冰箱：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.4 菌种活化及培养

从-80℃超低温冰箱中取出凝结芽孢杆菌BC99菌株，在PCA固体培养基上进行划线培养，培养条件为42℃有氧培养48 h。从长出菌落的培养皿中挑取单一菌落并无菌操作接种于PCA液体培养基中，培养条件为42℃、200 r/min培养18 h。指示菌的培养按2%的接种量接种到营养肉汤培养基中，培养条件为37℃恒温静置培养24 h。

1.5 凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品的准备

将活化后的凝结芽孢杆菌BC99接种于MRS液体培养基中，42℃、200 r/min摇床培养24 h后，对凝结芽孢杆菌BC99发酵液进行离心，4℃下，6 500 r/min离心15 min，取上清液过0.22 μm滤膜，过滤液即为代谢产物粗品，放置于4℃冰箱中保存备用。

1.6 凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌效果的评价方法

抑菌效果的评价采用牛津杯法。无菌生理盐水分别将指示菌菌液（大肠埃希菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌）梯度稀释成约1×108CFU/mL的菌悬液备用，待平板中的营养琼脂培养基凝固后，吸取0.1 mL指示菌溶液于固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，待平板表面的指示菌菌液全部涂布均匀并吸收后，在平板培养基表面放置无菌牛津杯，并在杯中加入凝结芽孢杆菌BC99的代谢产物粗品0.2 mL，在4℃冰箱中扩散培养4 h，将固体培养基在37℃下恒温有氧培养24 h，测定其代谢产物粗品的抑菌圈直径。其中牛津杯内径约为6 mm，每组3个重复，用抑菌圈平均直径来评价抑菌活性大小。

1.7 抑菌物质的研究

1.7.1 抑菌谱

采用牛津杯法，以大肠埃希菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌、产气荚膜梭菌、枯草芽孢杆菌、多杀性巴氏杆菌为指示菌，对凝结芽孢杆菌BC99进行抑菌能力的评价试验，其抑菌能力的大小以抑菌圈的直径来表示，对抑菌效果较好的菌株继续进行抑菌研究。

1.7.2 不同预处理pH值对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌能力的影响

用0.5 mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH调节凝结芽孢杆菌BC99的代谢产物粗品的pH值，pH值梯度为2、4、6、8、10，为避免不同 pH 值对指示菌的影响，在37℃下处理1 h后再回调pH值至6，做牛津杯抑菌试验，方法同1.6，采用指示菌进行试验，观察抑菌圈直径的大小，考察不同pH值预处理后对其代谢产物粗品抑菌能力的影响。

1.7.3 不同温度对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌能力的影响

将代谢产物粗品分别在不同温度梯度（-20、4、37、80、121℃）条件下处理30 min后测定抑菌能力，做牛津杯抑菌试验，方法同1.6，观察抑菌圈直径的大小，考察不同温度条件对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌能力的影响。

1.7.4 菌体及残留细胞对凝结芽孢杆菌BC99抑菌能力的影响

将凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品用微孔过滤膜过滤除菌后，将过滤液进行抑菌能力的试验，与未过滤的发酵菌液进行抑菌能力的比较，做牛津杯抑菌试验，方法同1.6，观察抑菌圈直径的大小，考察凝结芽孢杆菌BC99的菌体对抑菌能力的影响。

1.7.5 不同酶对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌能力的影响

用0.5 mol/L盐酸和0.5 mol/L氢氧化钠调节pH值至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和过氧化氢酶的最适pH值，将凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品与各种酶分别在37℃水浴条件下反应30 min后，再调节pH值至6，研究不同蛋白酶处理凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品，以未经酶处理的凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品为对照组。做牛津杯抑菌试验，方法同1.6，通过观察对照组和试验组抑菌圈直径大小，评价凝结芽孢杆菌BC99抑菌代谢物质是否为蛋白类物质。

2 结果与分析

2.1 凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌谱

凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品对指示菌的抑制效果见图1。

图1 代谢产物粗品抑菌谱Fig.1 Antibacterial spectrum of crude metabolites

由图1可知，凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品对革兰氏阴性菌和阳性菌均有一定的抑制程度，对常见的几种食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等具有较强的抑菌作用，对动物源的多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌也有一定的抑制效果，这说明凝结芽孢杆菌BC99的代谢产物具有广谱抗菌效果，对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物抗菌物质的研究有了更进一步研究的必要性。

2.2 不同预处理pH值对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌能力的影响

凝结芽孢杆菌BC99的代谢抑菌产物粗品在不同pH值条件下预处理1 h后，其对不同指示菌的抑菌效果如图2所示。

图2 不同预处理pH值对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌能力的影响Fig.2 Effects of different pretreatment pH on the antibacterial ability of crude metabolites of Bacillus coagulans BC99

由图2可知，在不同pH值条件预处理下，凝结芽孢杆菌BC99菌株的代谢产物粗品对4种不同指示菌的抑菌圈大小有不同影响。当预处理的pH值从2上升到6时，其凝结芽孢杆菌BC99菌株代谢产物粗品的抑菌圈直径逐渐增加，相应的抑菌活性呈上升趋势；当pH值大于6时，凝结芽孢杆菌BC99菌株代谢产物粗品的抑菌圈直径越来越小，相对应的抑菌活性逐渐下降。凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品在pH值为6时，其抑菌产物粗品的抑菌圈直径最大，抑菌活性也相应最大。说明凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品的抑菌效果最佳的预处理pH值在6左右。可能是预处理pH值过高或过低，其环境中H+的多少会使代谢产物中的抑菌物质结构遭到破坏，影响了其抑菌效果。

2.3 不同温度对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌能力的影响

采用不同温度对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品进行处理，其对指示菌抑菌效果如图3所示。

图3 不同温度对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌能力的影响Fig.3 Effects of different temperatures on the antibacterial ability of crude metabolites of Bacillus coagulans BC99

由图3可知，在37℃条件下处理的凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品具有最高的抑菌活性，说明此温度是凝结芽孢杆菌BC99最佳的拮抗其它菌株的温度。当温度达到80℃时，代谢产物粗品仍存在较高的抑菌活性，当121℃处理30 min时，其代谢产物粗品的活性大幅下降，说明凝结芽孢杆菌BC99抑菌代谢物质已大部分失活。凝结芽孢杆菌BC99处于温度较低（4℃）或常温（25℃）条件时，其代谢产物粗品仍具有一定抑菌能力，其抑菌活性还保持在一个比较好的水平，说明凝结芽孢杆菌BC99抑菌代谢物质在冷藏保鲜中可以作为一种生物保鲜剂或食品保鲜剂，延长食品的保质期[20]，在食品方面具有实际的应用价值。

2.4 菌体及残留细胞对凝结芽孢杆菌BC99抑菌能力的影响

以凝结芽孢杆菌BC99培养的发酵菌液和代谢产物粗品进行相应的抑菌圈试验，比较其菌体或残留细胞对不同指示菌的抑菌效果，如图4所示。

图4 凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品和菌液抑菌能力的对比Fig.4 Comparison activity between the crude metabolites and bacterial liquids of Bacillus coagulans BC99

由图4可知，相同体积的过滤后代谢产物粗品抑菌能力稍低于含凝结芽孢杆菌BC99的菌体及残留细胞的发酵菌液。表明凝结芽孢杆菌BC99对指示菌的抑制作用主要来源于其胞外代谢产物。

2.5 不同酶对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌能力的影响

对凝结芽孢杆菌BC99的代谢产物粗品进行不同蛋白酶的处理，对指示菌的抑制效果如图5所示。

图5 不同酶对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品抑菌能力的影响Fig.5 Effects of different enzyme on the antibacterial ability of crude metabolites of Bacillus coagulans BC99

采用各种酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K）对凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品进行处理后，处理组的抑菌圈直径明显低于对照组（P<0.05）；而采用过氧化氢酶处理后，处理组的抑菌活性与对照组差异不显著（P>0.05）。说明凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品对胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K蛋白酶的水解作用较为敏感，而对过氧化氢酶的作用效果无明显变化。说明凝结芽孢杆菌BC99的代谢产物中不含过氧化氢或者含量极低，凝结芽孢杆菌BC99能起到抑菌作用的代谢产物可能是一种分泌在胞外的蛋白类的细菌素类物质。

3 讨论与结论

通过对凝结芽孢杆菌BC99（Bacillus coagulans BC99）的代谢产物进行研究，考察其代谢产物粗品在不同预处理pH值、不同温度、抑菌物质粗品和菌液、不同酶处理后抑菌效果的影响，研究凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品的抑菌特性。结果表明，凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有一定的抑制作用，且具有较强的广谱抗菌效果；凝结芽孢杆菌BC99代谢产物粗品的抑菌效果最佳的预处理pH值在6左右；凝结芽孢杆菌BC99在37℃条件下，代谢产物粗品具有最高的抑菌活性。在温度较低（4℃）或常温（25℃）条件下，其抑菌活性还保持在一个比较好的水平，说明凝结芽孢杆菌BC99代谢产物抑菌物质在冷藏保鲜中有作为一种生物保鲜剂，延长食品保质期的潜力，在这方面有待后续研究。通过对凝结芽孢杆菌BC99的代谢产物抑菌物质进一步进行研究，在排除有机酸代谢产物和凝结芽孢杆菌BC99的菌体干扰后，用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、过氧化氢酶等多种酶处理代谢产物粗品，结果发现其对过氧化氢酶不敏感，而对其它蛋白酶敏感，说明凝结芽孢杆菌BC99代谢产物中主要的抑菌物质可能是对蛋白酶敏感的细菌素类物质。而这些细菌素类物质仍需要进行进一步的分离纯化，对其分子量大小、代谢含量、用法用量等方面进行研究，为其在肠道菌群调节、食品保鲜、青贮饲料等领域的应用，建立相关理论基础。