董永胜，马　蕾，王艳杰

（齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南250353）

提高微生物谷胱甘肽产率措施的探讨

董永胜，马蕾，王艳杰

（齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南250353）

谷胱甘肽是生物体内具有重要生理功能的活性物质，具有清除自由基、解毒、预防糖尿病和癌症、抑制衰老、抑制艾滋病病毒、提高人体免疫力等功能，广泛应用于医疗保健和食品等行业，谷胱甘肽主要由微生物发酵产生。该文介绍了微生物生产谷胱甘肽的现状，综述了微生物生产谷胱甘肽过程中优良菌株选育、发酵过程优化与控制等提高谷胱甘肽产率的策略与措施，并对发酵法生产谷胱甘肽需解决的问题进行了展望，旨在为微生物发酵生产谷胱甘肽的研究提供参考。

谷胱甘肽；微生物；产率；措施

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种含有巯基的活性三肽物质［1］，具有清除自由基、解毒、抑制衰老、预防糖尿病和癌症、抑制艾滋病病毒、提高人体免疫力等重要生理功能［2-4］。谷胱甘肽不仅作为试剂广泛应用于生化、生物学、化学、医学等领域的研究与测定［5-6］，而且已在临床医疗、防衰老、保健、食品制作、养殖等行业引起人们日益广泛的关注［7-9］。微生物发酵法是谷胱甘肽生产普遍采用的方法，谷胱甘肽是由微生物胞内的谷胱甘肽合成酶系催化而成，该酶系由γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶（GSH-Ⅰ）和谷胱甘肽合成酶（GSH-Ⅱ）组成。微生物在生长代谢过程中产生谷胱甘肽的前体物质，进而在酶系的催化下合成谷胱甘肽。在谷胱甘肽生产过程中，影响其产率的主要因素包括生产菌株胞内谷胱甘肽合成酶系的活性、微生物发酵条件控制、谷胱甘肽代谢调控等。该文综述了提高谷胱甘肽产率的策略与措施，并对发酵法生产谷胱甘肽需解决的问题进行了展望，旨在为微生物发酵生产谷胱甘肽的研究提供参考。

1　利用微生物生产谷胱甘肽的研究概况

谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、发酵法、酶（或固定化细胞）法等。微生物发酵法是以糖类为原料，利用特定微生物体内的物质代谢将糖类转化为谷胱甘肽的方法，是目前谷胱甘肽工业化生产的主要方法，该法通过选育（或构建）谷胱甘肽合成能力强和胞内含量高的微生物，筛选和优化培养基配方、建立和优化发酵控制策略、改进和提高下游过程技术等，最终提高谷胱甘肽的产率和质量。发酵法生产谷胱甘肽所采用的微生物通常是酵母菌，基因工程大肠杆菌谷胱甘肽的产量一般比酵母菌高，但其生产技术难度较大，相对还不够成熟。目前采用基因工程大肠杆菌生产谷胱甘肽的研究有了很大进展，其发展前景广阔。

微生物发酵生产谷胱甘肽的研究报道相对较多，主要是关于培养基组分及发酵条件优化的研究，目的是为了提高谷胱甘肽的产量。潘亚磊等［10］对酿酒酵母生产谷胱甘肽采用分批补加葡萄糖培养，GSH质量浓度达到72.49 mg/L，提高了2.86倍。吴祥庭等［11］对酿酒酵母WD-1合成谷胱甘肽的培养基组成和发酵条件进行了优化，谷胱甘肽的产量达223.22 mg/L，提高了36.81%。此外，对培养基的特殊成分及培养方法也进行了研究，郑丽雪等［12］在酿酒酵母CS10515-1生产谷胱甘肽的研究中，添加K+、Mg2+、Fe2+，GSH的产量分别为88.53 mg/L、52.73 mg/L、41.42 mg/L，分别提高了63.50%、36.58%和44.25%。钱卫东等［13］对多形汉逊酵母DL-1采用变温调控分批发酵，GSH总产量为420.76 m g/L，提高了2.34倍。

2　提高微生物谷胱甘肽产率的策略与措施

采用微生物生产谷胱甘肽，除了优化培养基和发酵条件外，还需要选育高产菌株、提高菌体的细胞密度及采取代谢调控等生产策略，目前，提高谷胱甘肽产率常采取的措施有以下几方面。

2.1高产谷胱甘肽菌株的选育

由于谷胱甘肽是胞内产物，野生型微生物细胞中含量普遍不高，因此，发酵法生产谷胱甘肽的关键技术之一在于如何提高微生物胞内含量。高产谷胱甘肽的菌株主要来源于传统的育种方法和基因工程技术构建的高产谷胱甘肽合成酶系活性的工程菌。

2.1.1诱变育种

为提高微生物胞内谷胱甘肽的含量，研究人员进行了诱变育种研究，取得了一定成果。贾学杰等［14］对酵母采用硫酸二乙酯和紫外诱变及ZnCl2、乙硫氨酸抗性交替筛选，酵母胞内GSH的含量提高了73.5%。庞德钦等［15］对啤酒酵母SC-20采用氩气等离子体射线和紫外照射处理，获得菌株的GSH含量提高78.33%。陈雪等［16］对酵母采用紫外线和亚硝基胍进行诱变以及使用乙硫氨酸、氯化锌和三氮唑为筛选模型，得到谷胱甘肽产量为864 mg/L的菌株，为出发菌株的4.9倍。目前，谷胱甘肽生产菌株的诱变育种方法主要采用传统的化学诱变方法（亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等）和物理诱变方法（紫外线、X射线）相结合；为避免单一诱变剂产生的诱变饱和效应，也采用等离子体和紫外线两种诱变剂交替和复合使用的方法，并采用HgCl2和ZnCl2两种抗性筛选物交替使用，以避免菌体对同一种抗性物质产生的耐受性。

2.1.2基因工程育种

正常微生物胞内的谷胱甘肽合成酶系活性普遍较低，且GSH-Ⅰ是一个限速酶，其活性受到谷胱甘肽的反馈抑制，为了减轻这种抑制，需要提高酶系的活力或降低酶系对谷胱甘肽的敏感性。国内外研究人员通过将谷胱甘肽合成酶系的GSH-Ⅰ和（或）GSH-Ⅱ基因转化进入酵母或大肠杆菌细胞内，以期获得高产谷胱甘肽的基因重组菌株。目前基因工程育种都是从提高其胞内合成能力为目标，主要涉及谷胱甘肽的生物合成途径［17］、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢［18］及硫同化过程［19］等相关代谢酶的过表达或失活。LIAO X Y等［20］通过在大肠杆菌中表达2个拷贝数的GSH-Ⅰ和1个拷贝数的GSH-Ⅱ来提高谷胱甘肽合成酶系的活力，结果表明谷胱甘肽的产量达到34.8 mg/g（细胞湿质量），是目前所报道的在大肠杆菌（E.coli）中表达产量较高的。傅瑞燕等［22］将大肠杆菌的谷胱甘肽合成酶的基因克隆，转化到乳酸乳球菌中，重组菌胞内谷胱甘肽含量达到358 nmol/mg（蛋白）。FEI L W等［22］将酿酒酵母的GSH-Ⅰ和（或）GSH-Ⅱ基因克隆，并在毕赤氏酵母中表达，谷胱甘肽的产量达到4.14 g/L。沈继朵等［23］克隆大肠杆菌的γ-谷氨酰转肽酶，用该酶取代GSH-Ⅰ，构建工程菌，其γ-谷氨酰转肽酶活是出发菌株E.coli DH5α的21倍，以谷氨酰胺、半胱氨酸和甘氨酸为底物合成谷胱甘肽，其产量达到0.524 g/L。杨建花等［24］采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术获得嗜热链球菌中的谷胱甘肽合成酶基因gshF，构建重组毕赤酵母，重组菌生成的GSH是宿主菌的2.23倍。在谷胱甘肽生产菌株的基因工程育种中，由于酵母菌中的糖降解酶活性较高和大肠杆菌的生长特性，因此常用酵母或大肠杆菌作宿主菌，将GSH-Ⅰ和（或）GSH-Ⅱ基因转化进入其细胞内以获得重组菌株。

2.2高细胞密度培养

为获得高谷胱甘肽产率，除了提高微生物胞内谷胱甘肽产量外，还需要提高发酵液中菌体的密度，因此需要对微生物进行高细胞密度培养。提高微生物细胞密度需要对其生长的物理和化学环境进行优化，主要包括细胞生长环境的优化（培养基组分优化、特殊营养物质的添加、限制代谢副产物的积累）、细胞培养模式选择、细胞循环发酵等。赵波等［25］在流加葡萄糖的基础上流加硫酸铵并控制pH，通过高密度发酵提高细胞浓度来提高GSH产量，GSH产量和细胞干质量均大幅提高，分别为830 mg/L和41.5 g/L。尹良鸿等［26］运用了指数速率-DO-stat组合流加策略，即采用指数速率流加实现细胞高密度培养，采用DO-stat反馈流加实现GSH的高积累，细胞量、GSH产量和胞内GSH含量分别达到82.5 g/L、1 120.6 mg/L和1.46%，实现了高细胞密度和高胞内GSH含量的相对统一。实际生产中，不同微生物采用的高细胞密度培养方式不同，如采用重复补料分批培养技术培养酿酒酵母，每24 h更换50%的培养基，持续30 d，酵母细胞的产量可比连续培养系统提高3倍。

2.3添加前体物质提高谷胱甘肽产量

微生物在生产谷胱甘肽的过程中，所需的三种氨基酸是细胞在糖类代谢的基础上经过一系列生化反应后自身合成的，但这些合成途径易受到细胞自身性能和状况以及外界营养与环境条件的影响，如果前体物质不能满足谷胱甘肽合成的需要，会成为影响谷胱甘肽产率的因素。因此，微生物生产谷胱甘肽虽然是以葡萄糖为原料，但如在培养基中添加谷胱甘肽的前体物质也能提高谷胱甘肽的产量。WEN S H等［27］采用甲醇利用型酵母生产谷胱甘肽时，流加L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸溶液，控制发酵液中各种前体氨基酸的浓度为5～40 mmol/L，谷胱甘肽含量可达细胞干质量的3%以上。陈珊等［28］采用酵母突变株YF生产谷胱甘肽时，添加浓度为2 mmol/L的L-半胱氨酸，谷胱甘肽浓度提高了102%。尹良鸿等［29］采用氨基酸添加与高密度培养技术相结合，流加葡萄糖的同时添加L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸，酵母GSH产量和胞内GSH含量分别达1 725.3 mg/L和3.29%，比高密度培养提高了111.4%和100.6%。在实际生产中，不同微生物的生长代谢状况不同，并且三种前体氨基酸在谷胱甘肽合成中的作用不同，因此，每种氨基酸的添加时间、添加量都需要通过实验确定，以便达到最佳生产效果。

2.4发酵条件调控提高谷胱甘肽产量

微生物在高温、高渗透压或化学损伤等外在条件刺激下，会发生应激反应，此时，作为自我保护性物质的谷胱甘肽的合成量会有应激性的变化。利用这一特性，采取适当的条件刺激可以提高谷胱甘肽的含量。

2.4.1压力提高谷胱甘肽产量

压力对微生物也是一种刺激因子，在大多数情况下，生物反应器的压力对微生物的生长及胞内特定产物的含量有显著影响，因此，利用高压作为刺激条件，可以提高微生物胞内谷胱甘肽的含量。DONG Y S等［30］对处于对数生长期的酵母进行加压培养，在1.0 MPa压力下、培养6 h时酵母胞内谷胱甘肽比常压下同样培养时间提高了68.8%。周斌等［31］对面包酵母CICC1447采用加压处理，在压力0.5 MPa下处理，谷胱甘肽的产量比常压下提高了17.21%。

2.4.2盐胁迫提高谷胱甘肽产量

高渗透压条件对微生物也是一种外界刺激条件，微生物在高浓度盐溶液下培养也可提高谷胱甘肽的含量。王玉磊等［32］对产朊假丝酵母采用不同的无机盐（NaCl、K2SO4、KCl、Na2SO4）进行培养时发现适当浓度的Na+和K+对谷胱甘肽的合成具有促进作用，如在酵母细胞生长后期添加10 g/L的Na2SO4，谷胱甘肽的含量提高了22.6%。

2.4.3极端pH值提高谷胱甘肽产量

极端pH值对微生物也是一种外界刺激因素，聂薇等［33］对产朊假丝酵母（Candida utilis）WSH 02-08细胞赋予短时间的pH胁迫，GSH总产量达到737.1 mg/L，比恒定pH=5.5条件下的GSH产量提高了24.9%。郑丽雪等［34］对酿酒酵母2-10515的种子在pH3.5的条件下培养，然后进行发酵生产，其生物量、胞内谷胱甘肽含量分别提高了38.3%和39.5%。低pH使细胞膜的通透性改变，使胞内部分谷胱甘肽分泌到胞外［35］。SM IRNOVA G等［36］通过调控菌株培养的pH值，改变了谷胱甘肽分泌和摄入的动力学平衡，实现了谷胱甘肽的胞外积累。BACHHAWAT A K等［37］发现只有当细胞膜结构或通透性发生改变时，谷胱甘肽才有可能直接通过细胞膜渗透。因此，采用低pH处理微生物细胞，可使细胞通过二次合成谷胱甘肽使其产量增加。

3　展望

目前，对微生物发酵生产谷胱甘肽的研究主要集中在上述所述的几个方面，并取得了一定成果，国内工业化生产的技术要求已逐步得到满足，但仍存在菌株谷胱甘肽含量较低、分离纯化收率低、成本高等问题。随着谷胱甘肽需求的日益增加，对谷胱甘肽生产技术的研究也会更加深入，预期今后将在菌株育种方法、谷胱甘肽代谢机制、前体物的应用策略、膜通透性改变、应激机制以及分离纯化技术方面得到更有效和低廉的方法，以提高谷胱甘肽的产率，降低生产成本，拓展其应用领域，加速谷胱甘肽产业的发展。

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Discussion of enhancing glutathione yield by microbes

DONG Yongsheng，MA Lei，WANG Yanjie
（College of Bioengineering，Qilu University of Technology，Jinan 250353，China）

Glutathione is an active substance with important physiological function in organism，which has functions of scavenging free radical，detoxification，prevention of diabetes and cancer，inhibition of aging and HIV，improving human immunity and so on.It is widely applied in health care and food and other industries，and it is mainly produced by microbial fermentation.In this article，a brief introduction of the current situations of glutathione production by microorganism was presented.The measures for enhancing glutathione yield through strain screening，fermentation conditions optimization，metabolic regulation and so on were described in detail.In the end，the problems to be solved in fermentation process for glutathione production were briefly prospected.The aim was to provide reference for the research of glutathione produced by microbes.

glutathione；microorganism；yield；measuress

Q93-335

0254-5071（2016）05-0006-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．002

2016-01-06

山东省自然科学基金（2014ZRB01120）

董永胜（1964-），男，副教授，博士，研究方向为食品发酵。