白璐，程民 ，钱立庭

(1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院放疗科，合肥 230031；2.安徽省肿瘤医院放疗科)



食管癌干细胞在食管癌放疗耐受中的作用与机制

白璐1，程民1，钱立庭2

(1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院放疗科，合肥 230031；2.安徽省肿瘤医院放疗科)

最新全球肿瘤统计报告显示[1]，食管癌的发病率居癌症发病率的第八位，是第五大致死肿瘤。我国食管鳞癌(ESCC)在所有致死性肿瘤中居第四位，且绝大多数病患预后较差，总体生存率不到20%，局部肿瘤复发率为60%～80%[2]。多数病患在就诊时已处于中晚期加之放射耐受现象的存在导致放疗效果不佳。新近提出的肿瘤干细胞学说认为，肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤复发、转移、耐药及放疗耐受的根源[3]。本文就食管癌干细胞(ECSCs)标志物及肿瘤干细胞在食管癌放疗耐受中的作用与机制综述如下。

1食管癌肿瘤标志物及其临床应用

目前用于临床诊断的食管癌肿瘤标志物主要有CEA、 CYFRA21-1、SCC-Ag、VEGF、p53-Ab、COX-2 、miR-21[4]等，而MMP、TK1、NY-ESO-1[5]、POSTN[6]等蛋白近期被报道在食管癌早期表达，且与食管癌的转移、预后不良等因素密切相关，对食管癌的早期发现、分级及预后评估具有重要价值。但上述标志物的临床结果反馈提示早期敏感性与特异性较低，故寻找更为合适的肿瘤标志物对于提高早期食管癌的检出率、改善食管癌的预后情况具有重要意义。肿瘤干细胞学说认为，肿瘤干细胞是一群具有干细胞特性、表达干细胞标志物的细胞亚群，是肿瘤复发与转移的根本原因[7]。在食管癌实体瘤中，肿瘤干细胞的存在及所占比例往往与肿瘤的增殖、侵袭、转移、自我更新、放射线耐受等能力密切相关，并对预后产生重要影响。

2肿瘤干细胞及其分选方法

早期CSCs在白血病中发现并报道，后经证实广泛存在于实体肿瘤中，如食管癌、乳腺癌、前列腺癌、胶质瘤、卵巢癌、直肠癌等。肿瘤干细胞学说[8]认为，大多数实体肿瘤中含有肿瘤干细胞亚群，该亚群具有自我更新、多向分化、化疗耐药、放射线耐受等性质，是肿瘤发生、增殖、复发、转移、放化疗耐受的根本原因，并维持着肿瘤细胞群的活性与特性。检验CSCs的“金标准”是CSCs可在机体内形成肿瘤，并表现出干细胞与肿瘤细胞的特性[9]。而目前实验研究常使用的分选方法有：①侧群细胞分选法：利用CSCs高效外排DNA荧光染料Hoechst33342这一特性，采用流式细胞仪将其分选出来。分选出的细胞亦称为侧群细胞(SP)。②表面标志分选法：使用CD44、CD24、CD90、CD133、CD166、CD271等表面标志物作为分选标志，采用流式细胞仪或免疫磁柱将CSCs分选出来。③使用无血清液体培养基培养细胞，具有干细胞特性的细胞形成悬浮克隆细胞群，进而筛选出具有干细胞特性的细胞[10]。 ④使用ACAM(attached-cell Aldefluor method)方法，特异性地从食管癌等实体肿瘤中分选出具有干细胞特性的CSCs[9]。

3食管癌干细胞标志物

目前多数研究使用肿瘤干细胞表面标志物对CSCs进行定性与定量。如：乳腺癌干细胞表面标志物为ESA+CD44+CD24-/Low；前列腺癌干细胞表面标志物为CD44+CD133+；胰腺癌表面标志物为ESA+CD44+CD24+；直肠癌表面标志物为ESA+CD44+CD166+等[10]。ECSCs标志物目前没有统一标准，研究较多且应用较为普遍的有以下几种： CD44+[11]、CD44+/CD24-[12]、CD133+、CD90+、ABCG2 、Bmi-1[13]、CD271(p75NTR)+[14]ALDH1[9]及CTAs(Cancer-Testis Antigen)。

Smit等[12]使用CD44+/CD24-作为ECSCs表面标志物，从食管癌细胞系中分选出肿瘤干细胞亚群，并在细胞系和临床样本中证实该亚群具有放射线耐受性等肿瘤干细胞特性，认为CD44+/CD24-可作为分选与验证食管癌干细胞的标志物。另有报道认为，食管鳞癌中CD90+细胞具有高致瘤性及转移潜能，不仅增加肿瘤的发生率、自我更新与变异能力，其含量与肿瘤的耐药性也密切相关[13]，具有肿瘤干细胞特性，故认为CD90可作为ECSCs的表面标志物。Sun等[14]使用p75NTR作为表面标志物将ECSCs从食管癌细胞系中分选出来，并鉴定其性质，认为表达p75NTR阳性的细胞具有更强的肿瘤形成能力。Yang等[15]通过使用ALDH1A1作为分选标准分选出ECSCs，与ALDH1A1low细胞相比，ALDH1A1high细胞具有较强的致瘤性、侵袭性与转移性等肿瘤干细胞特性。在肿瘤细胞中表达CTAs等抗原可使细胞始终具有干细胞特性。Tabarestani认为，肿瘤细胞中存在表达CT基因的细胞群，可能是CSCs无性增殖的根本原因，故CTAs可能作为潜在的CSCs标志物[16]。目前ECSCs标志物没有统一标准，寻找更为特效的ECSCs标志物，对ECSCs的研究极为重要。

4食管癌干细胞放射线耐受性

肿瘤干细胞学说认为CSCs相比于普通肿瘤细胞或正常细胞具有更强的放、化疗耐受性，导致食管癌放疗效果不佳。Diehn等[3]认为CSCs经过放射线照射后产生的DNA损伤更小甚至可以避免DNA损伤，因此是肿瘤放射治疗失败的根源。此外，Bao等[17]认为相对于其他细胞而言，CSCs具有更完善的DNA损伤修复能力，因此具有放射线耐受性。Brunner等[18]提出食管癌放疗效果不佳与ECSCs的放射线耐受性、高侵袭性及转移性相关。肿瘤经过放射线辐照后，由于CSCs对射线耐受，存活CSCs再增殖，最终导致肿瘤复发与远处转移。Smit等[12]在细胞系和临床样本中皆证实肿瘤干细胞亚群的放射线耐受性。大量研究结果显示，ECSCs的放射线耐受性最终导致食管癌的放疗耐受、复发与转移，也解释了食管癌治疗效果及预后不佳的根本原因。

5食管癌干细胞放射线耐受机制

5.1相关蛋白及通路食管癌干细胞的放射线耐受性与其自身表达的蛋白及通路密切相关，包括ALDH1A1、Periostin、WNT10A、EMT、Wnt/β-catenin、Notch、OCT4、Bmi-1、SNAILl/SIUG和SHH等。

Yang等[15]认为CSCs通过高表达ALDH1A1使自身具有更强的侵袭、转移性，从而导致预后不佳。高表达ALDH1A1的CSCs通过MMP蛋白和EMT(epithelial-mesenchymal transition)途径使得食管鳞癌细胞具有更强的侵袭与转移性，从而具有更强的放射线耐受性。Periostin在食管鳞癌中较癌旁组织过度表达，并与肿瘤的血管形成、转移、放射线耐受、预后不良等因素密切相关。诱导Periostin低表达可降低食管癌的生长速度与侵袭能力，并导致ECSCs含量显著降低。故ECSCs可能通过高表达Periostin使自身具有放射线耐受性[19]。过表达WNT10A可促进肿瘤的转移侵袭及增值扩散能力，降低食管癌的存活率。Long等[20]通过流式细胞术检测到，过表达WNT10A可导致CSCs含量显著增加，提升肿瘤细胞的自我更新能力及放射线耐受性等干细胞特性。大多数放射线耐受的细胞高表达EMT，这可能与EMT可导致细胞低氧耐受、提高DNA修复能力，改变活化生长因子通路密切相关，CSCs高表达EMT，因此EMT在CSCs放射线耐受作用机制中发挥重要作用[21]。Zhang等[22]报道CSCs是一群放射线耐受的细胞，表现出较高的端粒酶活性，高表达β-catenin,OCT3/4 及β-integrin。ECSCs的放射线耐受性是由EMT通过激活Wnt/β-catenin通路获得[23]，ECSCs高表达Wnt/β-catenin信号通路的多种蛋白，如Wnt1、 FZD1-4、 GSK3β、CTNNB1 及 Cyclin D1。此外，Wnt/β-catenin通路在DNA损伤应答时被激活，其下游信号转导通路及DNA高效修复机制使得CSCs具有较强的放射线耐受性[24]，即便后期DNA损伤修复不成功，也可长时间耐受并存活。Wnt/β-catenin 途径也可能参与CSCs周期时相的再分布，通过影响细胞周期时相，使细胞产生放射线耐受性，故Wnt/β-catenin通路在ECSCs的放疗耐受性中起到重要作用。Notch信号通路在维持控制干细胞增殖、存活、变异与凋亡过程中亦发挥重要作用，HEY1与HEY2作为Notch信号通路的基本靶向基因，在食管癌的发展、转移、放疗耐受过程中起到重要作用[25]。但ECSCs放射线耐受性与Notch通路是否相关还需进一步研究。

5.2ROS水平食管癌干细胞放射线耐受性与其较低的ROS水平及较强的ROS清除能力相关。低水平ROS可诱导细胞在放射线造成的细胞凋亡和衰老前激活相关分子通路，减少放射线对细胞的损害。增加造血干细胞ROS的水平可降低细胞的自我更新能力[26]，较低水平的ROS对于维持CSCs特性及活性具有重要作用。Diehn等[3]报道，在人和小鼠的乳腺癌肿瘤干细胞中，ROS的含量水平显著低于非致瘤细胞，且具有更强的放射线耐受性。

5.3DNA分子修复机制肿瘤干细胞拥有特殊的DNA损伤应答系统与修复通路。 DNA分子是放射线对细胞作用的关键靶点，而CSCs损伤后迅速修复，使得自身凋亡不能是放射线耐受的关键原因。当肿瘤干细胞的DNA分子受损时，p53表达受抑且G1检查点激活促进DNA修复。Bao等[17]提出，CSCs具有较强的DNA损伤监测系统与损伤修复能力，检查点激酶Chk1/Chk2 在电离应激后激活，控制细胞周期，修复受损DNA双链。此外，Bmi-1在电离辐射后通过染色质富集，在DNA双链断裂早期应答中促进DNA进行修复。与非肿瘤干细胞相比，CSCs经过放射线照射后所表现出的DNA修复能力大大增强。因此，DNA损伤修复是CSCs放射线耐受的重要因素。

5.4细胞周期时相 成熟的肿瘤干细胞大多处于静止期，这一现象是导致其对放射线耐受的另一个重要因素。与非肿瘤干细胞相比，CSCs在G1时相早期产生的Cyclin D1表达增强，而在G1时相末产生并使细胞从G1时相过渡为S时相的Cyclin E的表达减弱。在S时相与G2M时相高表达的Cyclin A与Cyclin B在CSCs中表达较正常细胞减弱。普通细胞经过放射线照射后，会停滞在G2期时相，而ECSCs经过放射线照射后，细胞周期时相不会发生较明显改变[27]。此外，与非肿瘤干细胞相比，CSCs中EGFR、Ser705表达降低，c-Myc与p27表达显著升高，EGFR/Stat3/c-Myc/p27通路对于维持CSCs长时间处于静止期起到重要作用。经过放射线辐照后，ECSCs由于长时间处于静止期，避免了放射线造成的DNA损伤。故ECSCs长时间处于静止期是其具有放射线耐受性的重要原因[28]。

5.5放射线耐受的相关基因食管癌肿瘤干细胞具有放射线耐受性，与其特有的基因或基因的特殊表达密切相关。Huang等[11]在食管鳞癌中发现，Oct-4、Sox-2、Bmi-1 等“干细胞基因”在SP 细胞中的表达比非SP 细胞更高。

放射线耐受的ECSCs中Bmi-1表达水平显著升高，诱导Bmi-1表达降低后，细胞通过诱导凋亡、升高ROS水平等途径，增加自身放射线敏感性[29]。由miR-203调节Bmi-1在ECSCs的增殖与自我更新的过程中发挥重要作用。与非肿瘤干细胞相比，CSCs的miR-203表达水平减低，Bmi-1表达上调。而miR-203被证实可引起上皮干细胞向鳞状细胞转化。因此，Bmi-1在食管癌干细胞放射线耐受机制中起到重要作用。Oct-4是CSCs的重要基因，Oct-4蛋白作为干细胞的存活因子在维持细胞干细胞性质、能力方面起到重要作用，并在体细胞中诱导细胞多能性的表达。在食管鳞癌中，与非肿瘤干细胞相比，ECSCs过表达Oct-4[11]。故Oct-4在维持肿瘤干细胞的自我更新、放化疗耐受方面起到决定性作用。Nishii等[30]检测到肿瘤干细胞Sox-2 mRNA水平较非肿瘤干细胞明显升高，且表达Sox-2基因与其自我更新能力及肿瘤发生密切相关。高表达Sox-2的CSCs具有较强的放、化疗耐受性。肿瘤干细胞的特殊性质与基因密切相关，从基因角度入手，相信可以探究出更多关于肿瘤干细胞的特性及其发挥作用的机制。

6展望

肿瘤干细胞与食管癌的放射耐受性相关，直接影响食管癌的放射治疗效果。当然，由于肿瘤干细胞在肿瘤细胞中只占极小部分，选择更高效的鉴定和分选方法分选出更为特异的食管癌干细胞，是亟需解决的技术问题。此外，肿瘤干细胞基因在放疗耐受过程中的作用及机制仍需进一步探索。

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基金项目：安徽省自然科学基金资助项目(1508085SMH233)

作者简介：白璐，硕士在读，Email:1403898896@qq.com通信作者：钱立庭，主任医师，教授，硕士生导师，Email:money2004@sina.com

中图分类号:R735.1

文献标识码:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.02.003

(收稿日期：2015-11-02)

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