刘辉，季海峰，王四新，张董燕，王晶，单达聪，王雅民

（北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京海淀100097）



综述

饲用乳酸菌高密度培养的研究进展

刘辉，季海峰*，王四新，张董燕，王晶，单达聪，王雅民

（北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京海淀100097）

高密度培养是提高微生物产量的有效途径和手段。将高密度培养技术应用于饲用乳酸菌的生产，可以大大提高生产率，降低生产成本，并且加速乳酸菌制剂的商品化进程，使其能够更好地满足市场需求。本文就乳酸菌高密度培养的主要影响因素及培养方式进行了综述，为饲用乳酸菌的高密度培养提供参考。

乳酸菌；高密度培养；影响因素；培养方式

乳酸菌具有改善肠道微生态环境、增加营养物质利用率、提高动物机体免疫力等多种生物学功能。乳酸菌的生产主要通过液体培养，但由于乳酸菌对营养和培养条件要求比较苛刻，并且在生长过程中不断消耗营养底物和产生有机酸等代谢产物，抑制了菌体自身的生长繁殖，采用常规方法培养时培养液中的活菌数一般只能达到107～109cfu/mL，较低的生物量制约了乳酸菌的工业化生产及应用。

高密度培养（HDC）是提高微生物产量的有效途径和手段。由于不同菌种（或菌株）所能达到的最高菌体浓度相差较大，目前对高密度培养没有确切定义，一般是指在液体发酵培养中，采用一定的技术手段和设备将菌体密度提高到常规培养数倍以上的培养技术。相对于普通培养，高密度培养的优势在于可减少培养体积、缩短生产周期，获得较高的目标菌体密度，减少动力消耗从而降低生产成本（Riesenberg和Guthke，1999）。乳酸菌进行高密度培养，不仅与所用的培养基有直接关系，也与培养方式密切相关，其核心技术是在保证一定营养供给的同时解除代谢产物对菌体生长的抑制，即保持稳定的比生长速率、合理的营养供给和代谢产物的去除（李寅等，2006）。

1　影响乳酸菌高密度培养的因素

影响乳酸菌增殖的主要因素包括营养物质、培养温度、pH值、搅拌转速、接种量、培养时间、代谢产物等。乳酸菌要通过高密度培养技术达到理想的高浓度产量，需要优化一系列相关的工艺参数，消除或减少这些因素对培养的影响。

1.1营养物质乳酸菌对营养要求复杂，正常生长需要碳源、氮源、缓冲盐、微量元素、生长因子及水等基础物质（Dumbrepatil等，2008）。培养基中各组分的浓度和比例要适当，特别需要注意的是碳源和氮源的比例：碳氮比若偏小，菌体生长旺盛会导致提前衰老自溶；若过大，则菌体繁殖数量低；碳氮比合适，但碳氮源浓度高，会导致发酵初期菌体大量繁殖而后期生长缓慢，代谢废物过多引起菌体的代谢异常；碳氮比合适，但浓度过低，也会影响菌体的繁殖数量。因此，对发酵培养基各组分和比例进行优化筛选，使其能够满足乳酸菌的生长需要，是实现乳酸菌高密度培养的前提。柏建玲等（2007）以改良MRS培养基为基础，选择玉米浆、牛肉膏、乳糖、番茄汁、蛋白胨等7个营养因子进行培养基的优化。结果表明，嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等3种乳酸菌在优化的培养基中培养，细胞密度达到109cfu/mL以上，均高于原MRS培养基的细胞密度，并且发酵培养基的成本大大降低。高鹏飞等（2008）对Lactobacillus casei Zhang的增殖培养基优化后，经37℃、18 h培养，活菌数可达到4.78×109cfu/mL，比在MRS中的活菌数（4.8×108cfu/mL）提高近10倍。

1.2培养温度温度通过影响细胞膜的流动性以及胞内酶的活性来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢，因此选择适宜的发酵温度对菌体的生长繁殖意义重大。最适生长温度与菌株的种属和来源、所用培养基、培养条件和菌体的生长阶段等有关，一般而言，乳酸菌的最适生长温度为25～45℃。培养温度还会影响代谢产物的产量和质量。Gassem等（1997）认为在接种温度较低时活菌数量增加缓慢，有利于延长乳酸菌的对数期和稳定期，从而提高如胞外多糖等次级代谢产物的产量。

1.3pH值pH对微生物的生长代谢具有重要的影响。乳酸菌生长的最适pH值一般为5.5～6.5，过高或过低都不利于菌体生长，因此需要通过试验确定最适宜菌体快速生长和繁殖的pH值。冯镇和张兰威（2009）对嗜热链球菌St-1进行研究时发现，当培养基中的pH稳定在6.0时，其活菌数目以及发酵的活力最高。Beal等（1989）的研究则表明，保加利亚乳杆菌生长的最佳生长pH值为5.8，嗜热链球菌为6.5。

1.4搅拌转速乳酸菌在培养过程中会迅速利用营养物质产生代谢物乳酸，并且由于菌体比重较大容易沉积到发酵液底部，因此在培养过程中应适当搅拌，使营养物质和乳酸均匀分散，菌体能够及时利用营养物质并排出代谢产物。由于搅拌造成的剪切力对菌体的分裂生长不利，因此搅拌转速不宜过大，应通过单因素试验确定最佳值。

1.5接种量适宜的接种量也是保证菌体高产的重要因素。一般来说，接种量小，菌体迟缓期变长，发酵周期也相应延长；接种量大，有利于种子液中水解酶对基质的利用，可以缩短迟缓期，促进乳酸菌快速生长，但接种量过高会引起菌体过快生长，导致营养物质利用过快和代谢产物积累过多，反而不利于菌体后期生长。熊晓辉等（2004）对一株乳酸菌进行研究时发现，接种量为5%时的活菌数要高于接种量为3%和7%的活菌数。

1.6培养时间高密度培养的发酵终点判定十分重要，一般应在菌体生长达到稳定期初期时及时停止发酵，防止生长进入衰亡期影响菌体活力。为此需要考察菌体的生长曲线，通过检测不同发酵时间的活菌数，根据测得的活菌数最大值来确定最佳培养时间。

1.7代谢产物多数乳酸菌为同型乳酸发酵，其糖酵解途径的最终产物是乳酸。乳酸可作为一种解偶联剂使培养基中的质子进入细胞内，降低胞内pH值，最终导致菌体停止生长。如何消除发酵过程中乳酸积累对乳酸菌生长的抑制是实现乳酸菌高密度发酵的一个关键问题。目前，国外正在研究通过乳酸菌的代谢途径进行基因工程调控，以降低抑制产物的生成（Upadhyaya等，2014）。

2　乳酸菌高密度培养方式

乳酸菌高密度培养的主要方式有缓冲盐法、化学中和法、细胞循环培养法、透析培养法、补料分批培养法和微囊化培养法等。

2.1缓冲盐法培养基中乳酸不断积累导致pH降低是抑制乳酸菌生长的直接原因（Goncalves等，1997）。通过在培养基中添加缓冲盐，可调节和控制培养液的pH在一定范围内保持相对稳定，能在一定程度上缓解乳酸造成的低pH对菌体的抑制，促进菌体生长繁殖（Schoug等，2008）。常用的缓冲盐有磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和碳酸钙等。刘云鹤和何煜波（2002）对3种缓冲盐研究发现，添加一定量的缓冲盐对发酵乳杆菌和植物乳杆菌细胞的积累有显著促进作用，其中以磷酸氢二钾的促进作用最为明显，柠檬酸三铵次之，乙酸钠最弱。冯友军等（2003）将10%柠檬酸钠、5%乙酸钠和2%丙酮酸钠按一定比例配成复合缓冲体系，能使乳酸菌的发酵终浓度从2.22×108cfu/mL提高到1.32×109cfu/mL。由于缓冲盐的缓冲作用有一定的范围，发酵菌液不能达到很高的菌体浓度，而且高盐浓度也会对乳酸菌菌体的生长产生抑制作用。

2.2化学中和法通过流加中和剂，将乳酸菌发酵过程当中产生的过量乳酸中和，维持发酵液的pH保持在菌体生长的最适pH范围内，可以促进乳酸菌的生长。常用的中和剂有氨水、氢氧化钠、氢氧化钙和碳酸钠等。不同的中和试剂对不同菌株的作用不同。Krzywonos和Eberhard（2011）认为氨水比氢氧化钠溶液更适用于植物乳杆菌的发酵。而王艳萍等（2009）认为柠檬酸钠比氨水更适合嗜酸乳杆菌6012的生长繁殖。化学中和法可获得高密度的菌体，并且简便易行，是目前应用最广泛的一种方法，但当乳酸与滴加的碱液反应产生乳酸氨或乳酸钠等盐类物质的浓度到达一定的浓度时，也会抑制菌体的生长繁殖，其最高密度也只能达到109～1010cfu/mL（Mufandaedza等，2006）。

2.3细胞循环培养法细胞循环培养法是指在连续培养过程中采用沉积、离心、膜过滤（超滤、微滤膜等）等方法将流出发酵液中的菌体截留并返回到发酵罐中继续培养，同时向发酵罐中补充新鲜培养基保持发酵液体积恒定的培养方式。这种方式结合了连续培养和超滤的优点，既可以用低浓度的培养基得到较高的细胞密度，除去培养基中的抑制性代谢产物，又可以就地分离产物，强化下游操作。刘振民（2004）采用超滤膜对德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热亚种培养液进行了浓缩。结果表明，两种菌的菌体均可被超滤膜有效截留，浓缩后的菌体密度可达9.79×109cfu/mL。Hayakawa等（1990）采用耐热的无机膜错流过滤方法对干酪乳杆菌进行培养，活菌数可达1011cfu/mL。细胞循环培养存在的问题是膜容易污染，不能实现长时间的连续操作，如何选择合适的膜组件和克服膜污染的问题是研究的重点。

2.4透析培养法在发酵过程中，营养物质的消耗和代谢产物的积累是导致微生物生长停止的主要原因。培养时利用透析膜包裹微生物，并使外部有新鲜培养液流动的培养方法称为透析培养法。透析培养可以有效去除培养液中有害的低分子量代谢产物，同时向培养液提供充足的营养物质供菌体利用。与细胞循环培养法相比，透析培养中的透析膜不会被阻塞，可以长时间维持其渗透性能。这种培养方式可以省去耗时的培养基优化过程，大大提高了生物量的积累。Osborne（1977）将透析培养法用于乳酸杆菌培养，获得了1×1011cfu/mL的高菌体密度。但是，由于透析培养设备需要内嵌的透析膜或外在的透析组件、辅助泵及发酵罐等，设备投资较大，对操作技术要求较高，限制了其在实际生产中的应用。

2.5补料分批培养法补料分批培养法（又称流加培养法）是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段以某种方式间歇地或连续地补加新鲜培养基，使菌体及其代谢产物的生产时间延长的培养方式。其最大特点是能够调节培养环境中营养物质的浓度，不仅避免了过高的初始营养成分浓度产生的抑制，而且可以防止营养成分被耗尽后产生的限制作用。与透析培养和细胞循环培养相比，补料分批培养不需要增添设备，只需对工艺进行改进，并且操作简单、灵活，能够避免分批操作的许多缺点，现已成为细菌高密度培养中最有竞争力的方式之一。补料分批培养的关键问题是选择合适的补料流加策略。目前主要有两种策略控制流加营养物：反馈补料和非反馈补料。反馈补料包括pH-stat法、DO-stat法、菌体浓度反馈法、呼吸商法等；非反馈补料可分为恒速补料、变速补料、间歇补料和指数补料等。反馈补料中，pH-stat法和DO-stat法相对简单和便宜，因而较为常用。非反馈补料中，指数补料可以将反应器中基质的初始浓度控制在较低的水平，有效减少有害代谢物的积累，并使菌体密度以一定的比生长速率呈指数形式增加。刘振民等（2008）对保加利亚乳杆菌的补料分批培养进行了研究，结果表明：控制pH 6.0进行培养，在菌体生长的对数生长期末期进行全营养物料的连续补料，最终的菌体密度提高2个对数级，活菌数可达1.0× 1011cfu/mL。Xiong等（2012）比较了恒速补料、指数补料和分批培养对植物乳杆菌NCU116生长的影响，发现采用指数补料策略可以使菌体浓度达到9.35×109cfu/mL，远高于其他两种培养模式。

2.6微囊化培养法微囊化培养法是固定化技术的一种，是用一层亲水性的半透膜将细胞包围在珠状的微囊内，经连续培养后囊内细胞可以达到很高的密度。乳酸菌微囊化避免了传统悬浮发酵剂的缺点和限制，从培养基中分离细胞不需经过超滤或冷冻离心，使用普通的离心或过滤就可进行，因此大大降低了生产成本。另外，微囊化技术可以防止氧对双歧杆菌等厌氧菌的伤害，在冷冻过程中有很好的保护作用。闫颖娟等（2014）采用微囊化技术将保加利亚乳杆菌FMG-4包裹在球状的液芯微囊内，采用连续培养的方法进行高密度培养，菌体密度达到3.18×1011cfu/g。Doleyres等（2002）利用结凝胶固定化进行长双歧杆菌培养，其菌体密度是细胞悬浮培养的9.5倍。

3　结语

乳酸菌的高密度培养已成为当前发酵工业的研究热点之一，也是实现乳酸菌规模化生产的重要目标和方向。乳酸菌的高密度培养已广泛应用于乳制品行业，而在饲料行业中的研究和应用才刚刚起步，仍有诸多技术难题尚待解决，如适合的饲用乳酸菌菌种相对较少、菌体代谢理论不完善、对发酵设备和发酵条件的要求高、工艺调控过程复杂、对生产成本控制要求较高等。随着高密度培养技术广泛应用于饲用乳酸菌的生产，将大大提高乳酸菌的生产效率，降低生产成本，加速饲用乳酸菌制剂的商品化进程，从而更好地满足市场需求和提高产品在市场上的竞争力。

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High density culture is an effective way and means to improve the production of microorganism.The high density culture technology used in the production of Lactic acid bacteria preparation would increase the product efficiency，reduce the cost of production，and accelerate the commercialization process of Lactic acid bacteria preparation to meet the market demand.This paper reviewed the main influencing factors and culture methods of high density culture，which would offer the

for the high density culture of Lactic acid bacteria preparation in feed.

Lactic acid bacteria；high density culture；influencing factors；culture methods

S816.7

A

1004-3314（2016）04-0011-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160403

北京市科技计划（Z141100002614002）；生猪产业技术体系北京市创新团队项目（GWZJ-2009-06）；北京市农林科学院青年科研基金（QNJJ201408）