邵婷婷

(杭州澳医保灵药业有限公司，浙江 杭州 310018)

银杏酮酯的提取分离技术研究进展

邵婷婷*

(杭州澳医保灵药业有限公司，浙江 杭州 310018)

银杏叶的主要活性成分为黄酮类化合物及萜内酯，因其具有很高的药用价值而受到广泛关注，如何对银杏酮酯进行有效的提取和分离一直是国内外关注的焦点。本文介绍了银杏叶的主要活性成分及药理作用，重点综述了近年来银杏酮酯提取及分离方面的新技术，对各类技术的优缺点进行比较，并对银杏酮酯提取分离技术的发展趋势进行了展望，以期为更高效合理地开发银杏酮酯产品提供参考。

银杏叶；黄酮类化合物；银杏内酯；提取；分离

银杏素有“活化石”之称，是我国历史悠久的特产植物，它的叶、果及种子等部分都具有很高的药用价值，一直受国内外的广泛关注。自20世纪60年代，人们对银杏叶的化学成分、药理作用、提取分离、检测鉴定等方面开展了大量的研究工作[1-2]。目前，银杏资源的开发已取得一定成果，全球每年银杏叶提取物制品的总销售额达100多亿美元，在医药、生物农药、食品和化妆品等方面都得到了广泛的应用。银杏叶提取物制品已成为一种集医疗、营养、保健功能于一体的天然绿色资源[3-4]。国外银杏叶提取产品的发展始于20世纪70年代，德国Schwabe公司、Sobernheim公司、法国Beaufour-Ipsen公司、日本Hevert公司等先后进行了银杏叶产品生产技术的开发[5]。我国虽有世界70%以上的银杏叶产量，银杏叶提取产品却仅占国际市场需求的1/6。近年来，我国银杏叶产品的制备技术虽然有了一定的发展，但水平仍然相对较低，特别是质量要求较严格的药业用产品仍然需要依赖进口。在当前“回归自然”潮流影响下，银杏产品的开发及应用日益受到国内外的广泛重视。欧美等发达国家进一步提高产品质量标准，给我国银杏产品的出口提出了更高的要求。我国急需进行银杏叶产品深加工的技术创新，实现产品从单一到多元化、从低端到高端的突破。如何提纯、精致银杏叶提取物，并实现各种有效成分的分离纯化，已成为开发高端银杏产品的技术关键。本文综述了银杏酮酯的提取及分离纯化工艺研究现状，并对各类技术的优缺点进行比较，以期为更高效合理地开发银杏产品提供参考。

1 银杏叶的主要活性成分

银杏叶富含萜内酯、黄酮类化合物、氨基酸、维生素和矿物质等多种成分。药理研究表明，银杏叶主要的活性成分为黄酮类化合物和萜内酯(银杏酮酯)[6]。黄酮类化合物目前已经分离出30多种成分，主要有山萘素、槲皮素和异鼠李素及相应的双、三糖苷等。临床研究表明，黄酮类化合物具有较好的抗氧化、抗自由基、抗微生物、抗肿瘤等作用，并对神经系统具有保护作用[7]。萜内酯包括银杏内酯A、B、C及白果内酯等，主要为二萜和倍半萜类化合物。研究表明，银杏内酯可选择性抵抗血小板活化因子，对心血管、脑血管、动脉硬化、高血压等疾病具有特殊的疗效[8]。

2 银杏酮酯的提取方法

2.1 有机溶剂萃取

有机溶剂萃取是最为传统的天然产物有效成分提取方法之一，也是目前国内外使用最广泛的提取方法。德国Schwabe公司是最先利用溶剂萃取技术生产标准银杏叶提取物(EGb761)的企业，其中银杏黄酮>24%，内酯>6%，银杏酸<5×10-6。由于有机溶剂萃取具有残留量大、污染等缺点，目前的研究主要集中在寻找合适的萃取剂方面。乙醇具有绿色无毒、可再生等诸多优点，近年来多用于银杏酮酯的提取工艺研究中[9]。但该方法得到银杏叶的粗提取物中有害成分银杏酸的含量较高[10]。哥伦比亚大学Dirk等[11]利用银杏内酯的结构特征，首先采用煮沸的双氧水(H2O2)降解不需要的组分，然后采用乙酸乙酯提取、碱洗和活性炭吸附提取银杏内酯，并采用反向色谱柱去除银杏酸，最终获得了满足药用需要的银杏内酯产品。针对有机溶剂的残留、污染问题，张春晓等[12]探索了以水为浸提液提取银杏酮酯，采用水-聚乙二醇两相溶液萃取分离银杏黄酮的绿色方法，并对提取温度、溶液pH值等工艺条件进行优化。郎庆勇等[13]建立了加压水提银杏酮酯的新方法，结果表明，该方法与传统溶剂提取相比，提取效率更高、选择性更强。

2.2 超临界流体萃取

超临界流体萃取技术主要是利用超临界流具有的扩散系数大、粘度小、渗透性强、传质速率快等特点，进行天然产物中有效成分高效地提取。由于各种物质的超临界温度、压力不同，目前超临界二氧化碳(CO2)是最适宜应用于天然产物提取的流体。在提取银杏叶有效成分方面，由于CO2的极性较低，使得其对银杏酮酯的提取效果不佳。因此，选择合适的夹带剂提高提取率，是实现超临界流体萃取技术在银杏酮酯提取方面应用的关键。韩国首尔大学Young 等[14]在CO2超临界流体中加入H2O进行改性。结果表明，增加4% H2O可使得银杏酮酯的收率增加80%～150%，且银杏叶中有害成分银杏酸的含量大大降低。台湾中兴大学邱寇龙等[15]对超临界CO2、二氧化氮(N2O)和1，1，1，2-四氟乙烷(R134a)在萃取银杏酮酯方面的可行性进行研究。结果表明，当在超临界溶剂中加入乙醇后，萜内酯的收率随着乙醇浓度的增加迅速增加，超临界CO2加入乙醇后得到的萜内酯收率最大。浙江大学苗士峰等[16]以乙醇作为夹带剂采用超临界CO2制备银杏黄酮，优化获得的最佳工艺条件：压力为20 MPa、温度为40 ℃、CO2流量为10 g·min-1、乙醇流量为6 mL·min-1，黄酮的收率为3.6 mg·g-1。目前，超临界萃取银杏酮酯的收率仍相对较低，寻找绿色、高效的夹带剂仍是今后一段时期内的研究重点。

2.3 微波辅助提取

微波能利用物质介电常数的不同，对天然产物中不同组分进行选择性作用，使植物组织中的不同组分以不同速度从基体分离。将微波提取技术应用于银杏酮酯的提取，不仅可以提高提取率，还可以缩短提取时间、减少溶剂使用量。梁晓峰[17]对银杏黄酮的微波辅助提取及乙醇溶剂萃取工艺条件进行优化对比。结果表明，微波辅助提取可将黄酮的收率从5.0 mg·g-1提高至8.2 mg·g-1。朱兴一等[18]对微波辅助提取银杏内酯的工艺进行研究，结果表明，微波辅助提取比传统溶剂热回流提取的收率高31%，溶剂用量减少33%。目前该技术仍处于实验室及中试研究阶段，实现其在天然产物提取方面的工业化应用，仍然需开展进一步研究。

2.4 超声波辅助提取

超声辅助提取天然产物中的活性成分，是最近十几年发展起来的一种有效技术。当超声波在连续介质中传播时，波阵面上会引起天然产物介质质点的运动，部分质点获得巨大的动能和加速度后，将迅速逸出植物基体而游离于萃取溶剂中。高晗等[19]采用响应曲面法对超声波辅助提取银杏黄酮工艺条件进行优化，结果表明，在超声时间为21.7 min、温度为39.3 ℃、时间为2.0 h的最优工艺条件下，银杏总黄酮的收率为40.8 mg·kg-1。钟平等[20]对超声波和微波两种不同提取银杏总黄酮的方法进行比较，发现超声波提取银杏黄酮的收率比微波提取高8.8%。到目前为止，超声波在提取天然产物有效成分方面已经得到了广泛的应用。解决超声波萃取装置的放大及精确控制等问题，以实现工业大规模应用仍是今后的研究重点。

2.5 酶辅助提取

由于银杏叶有效成分主要包裹在以纤维素为主的细胞壁内，而传统溶剂浸提法无法使包围活性成分的细胞壁破裂，使萃取过程存在较大的传质阻力。酶解过程能使细胞壁降解而疏松、破裂，减小传质阻力，提高提取效率。喻春皓等[21]采用响应曲面法对银杏内酯的纤维素酶辅助提取工艺进行研究，结果发现，该方法可将银杏内酯的收率提高66.67%。庞允等[22]将乙醇提取法和酶解法提取银杏叶黄酮进行比较，结果表明，乙醇提取法收率为12.9 mg·g-1，酶解法为17.8 mg·g-1。陈硕等[23]研究发现，斜卧青霉在降解银杏叶细胞壁的同时，还能将较多的黄酮类化合物转化为极性苷元，促进银杏黄酮的溶解，在最优工艺条件下银杏黄酮的收率比非酶解情况下高约一倍。综上可见，酶强化提取明显优于传统提取方法，且操作简单、效果显著，但有效成分收率提高的同时杂质含量也随之增加，如何进行后续分离纯化，还有待进一步研究。

2.6 不同提取方法的对比

溶剂提取法由于提取效率低、杂质含量高等缺点，难以满足高纯度银杏酮酯产品的生产需要。酶强化提取技术虽能有效提高银杏酮酯的提取效率，但提取过程对工艺参数的要求较高，且杂质含量高，后处理难度较大，短期内难以实现工业化应用。银杏酮酯类化合物多具有极性，限制了超临界CO2萃取技术的应用，虽然增加夹带剂可以提高收率，但用于工业化生产仍然面临着投资高、设备能耗大等诸多问题。相对而言，超声波、微波辅助提取法对银杏酮酯类化合物的选择性好、提取效率高、能耗低、投资费用少，较适合银杏酮酯的工业化生产。

2.7 联合提取新技术

将各类提取方法的优势进行互补，采用联合提取技术提高银杏酮酯的收率及提取效率是近年来新的研究方向。Riera等[24]针对超临界流体萃取的提取效率低等缺点，对超声波-超临界CO2联合从银杏叶中提取银杏酮酯的方法进行探索，并取得较好的效果。李莹等[25]建立了微波-超声波联合提取银杏黄酮的新方法，在最佳工艺条件下银杏黄酮收率为58.1 mg·g-1，远高于超声波或微波单独使用时的提取率。倪林等[26]建立了微波-高压联合提取银杏黄酮的新方法，在最优工艺条件下，可将微波辅助提取的收率提高91%。吴昊等[27]建立了超声波协同酶解强化提取银杏黄酮的新方法，结果表明，该方法可以大大提高银杏黄酮的收率、缩短提取时间。上述方法在银杏酮酯的提取方面有较好的应用前景，但目前仅停留在实验室研究阶段，离工业化生产还有较远的距离。

3 银杏酮酯的分离纯化研究

3.1 溶剂萃取分离

溶剂分离纯化银杏叶提取物工艺是较早在工业中得到应用的精制方法。溶剂纯化过程一般包括提取液浓缩、水析、去杂，溶剂萃取、浓缩、干燥等过程。余陈欢等[28]以60%乙醇为溶剂采用多级逆流萃取的方法对银杏酮酯进行提纯工艺研究。优化出的最佳工艺条件：液料比为16 mL·g-1、萃取时间为30 min、温度为80 ℃，获得银杏黄酮和银杏内酯的收率分别为17.4 、24.2 mg·g-1。郎庆勇等[29]利用银杏内酯结构的可逆电离及酯化特性，采用碱性磷酸氢二钠(Na2HPO4)溶液使内酯电离，然后用酸性二氯甲烷(CH2Cl2)溶液萃取获得银杏黄酮，该方法具有操作简单高效、溶剂消耗量少等优点。后续应进一步寻找绿色高效的萃取剂，拓展超临界反溶剂萃取、双水相萃取、反胶束萃取等新兴高效萃取技术在银杏叶有效成分分离方面的应用。

3.2 树脂吸附分离

吸附树脂属于高分子聚合物，由于其在天然产物分离方面具有选择性高、再生简单以及性能稳定等优点，近些年在工业中得到了迅速发展。张静等[30]以聚酰胺树脂为介质进行银杏黄酮的柱层析分离纯化研究，结果表明，聚酰胺树脂吸附效果显著，在工业化制备银杏黄酮方面具有较好的应用前景。李月[31]对市场上常见的4种大孔吸附树脂分离纯化银杏叶总黄酮的性能进行比较，结果表明，HPD100型大孔吸附树脂效果最佳。周芸等[32]自制交联聚对乙烯基苄基脲树脂(PMVBU)，并将其应用于银杏叶黄酮的纯化。结果表明，该树脂对银杏黄酮的吸附率高、易洗脱，且重复使用性好。剑桥大学李晶等[33]将扩张床吸附运用于银杏黄酮的提取工艺，并与液-液萃取、填充床吸附等工艺进行比较。结果表明，该方法可大大简化纯化操作步骤，降低时间和费用消耗，具有较好的工业应用前景。采用树脂吸附法精制银杏叶提取物能得到高纯度的产品，且溶剂残留量少。研究高活性、高寿命、易再生的吸附树脂，降低银杏产品的生产成本仍然是今后一段时期的重点。

3.3 色谱分离纯化

色谱分离技术是利用不同物质在固定相和流动相中具有不同分配系数这一原理进行物质分离的。因其具有选择性好、分离效率高等优点而广泛应用于天然产物的提纯分离工艺中。邱峰等[34]将三氯甲烷、甲醇和水的混合液作溶液，采用高速逆流色谱与核磁共振检测相结合(HSCCC-qHNMR)建立在线分离纯化银杏内酯的新方法。结果表明，在溶剂中增加适量的二甲基亚砜(DMSO)可显著提高银杏内酯的收率，该方法高效、精确，获得的各银杏内酯纯度高于95%。刘晶等[35]将正己烷、乙酸乙酯、甲醇与水的混合液作溶剂，建立了高速逆流色谱与蒸汽发光散射检测相结合(HSCCC-ELSD)在线分离纯化银杏内酯的新方法。结果表明，该技术使用简便，分离得到的银杏内酯A、B、C及白果内酯纯度高于98%。YU-Chieh Chen等[37]以乙醇与水的混合物为溶剂，分别采用C18分离柱和强阴离子交换膜法，批量从银杏叶粗提取物中分离提取银杏黄酮。结果表明，C18柱分离获得的银杏黄酮最大收率为60%，强阴离子交换膜分离获得的银杏黄酮最大收率为50%。综上，色谱分离技术在分离纯化银杏酮酯产品方面具有分辨率高等显著特点，具有较好的应用前景。

3.4 不同分离技术的对比

溶剂萃取纯化工艺具有操作简便、投资少等优点，但产品杂质含量高、溶剂残留量大，难以满足高纯度银杏酮酯的生产需要。色谱分离技术虽分辨率较高，但其投资成本高、放大难度大，目前只用于少量产品的制备，短期内难以实现大批量的工业化生产。而吸附树脂分离纯化银杏酮酯具有工艺简单、产率高等特点，且其工艺流程已日趋成熟，较易实现银杏酮酯产品的工业化生产。

4 展望

随着人们对银杏酮酯生物活性研究的深入，其在食品、医药等行业的应用范围不断扩大，对银杏酮酯进行制备、分离纯化技术的要求也不断提高。从提取工艺方面看，改进提取技术，将超声波、微波、超临界流体萃取等方法运用于银杏叶有效成分提取工艺中，特别是综合各种方法的优缺点，将各种提取技术耦合，研究银杏酮酯的联合提取技术将会成为今后一段时期的热点。从分离纯化角度看，需要进一步探索膜分离、超临界反溶剂萃取、高效逆流色谱分离等现代分离技术在银杏酮酯产品制备方面的应用研究，需要进一步开发高吸附、高寿命、低成本及性能稳定的吸附树脂，并早日实现其在银杏酮酯分离纯化方面的工业化应用。从银杏叶资源的开发利用方面看，目前多数研究仅局限在提取黄酮类化合物、萜内酯、多糖、银杏酸等单一成分方面，而从银杏叶中同时提取多种有效成分并优化提取工艺的研究较少。开展银杏叶多种成分的同时提取、分离及检测技术方面的研究，对于高效、充分利用银杏资源具有重要意义，需要进一步加强研究。

[1] Sabater-Jara A B，Souliman-Youssef S，Novo-Uzal E，et al.Biotechnological approaches to enhance the biosynthesis of ginkgolides and bilobalide in Ginkgo biloba[J].Phytochem Rev，2013，12(1)：191-205.

[2] Teris A van Beek.Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts[J].Journal of Chromatography A，2002，967(1)：21-55.

[3] 王琛，李昌煜.银杏叶提取物药理作用研究新进展[J].中国现代中药，2009，11(3)：10-13.

[4] Kratz J M，Terrazas C B，Motta M J.Determination of Chemical Composition and In Vitro Dissolution Profiles of Herbal Drug Products Containing Ginkgo biloba Available on the Brazilian Market[J].Natural Product Research，2008，27(5)：674-680.

[5] 陈西娟，王成章，叶建中.银杏叶化学成分及其应用研究进展[J].生物质化学工程，2008，2(4)：57-62.

[6] Bikram S，Pushpinder K，Gopichand，et al.Biology and chemistry of Ginkgo biloba[J].Fitoterapia，2008，79(6)：401-418.

[7] Rickarda N S，Kowadloa N，Gibbs M E.Effect of the Ginkgo biloba extract，EGb761，on memory formation in day-old chicks[J].Pharmacology，Biochemistry and Behavior，2001，69(4)：351-358.

[8] Bruce J D，Mary R B.Ginkgo biloba Indications，Mechanisms，and Safety[J].Psychiatric Clinics of North America，2013，36(1)：73-83.

[9] He J，Yang S，Yang J，et al.Extraction of ginkgolides from Ginkgo biloba[J].Photochemical and Photobiological Sciences，2010，53(9)：1127-1135.

[10] 周可好.银杏叶提取物的杂质成分分析[J].现代农业科技，2010，4(14)：11-14.

[11] Dirk L，John M B，Koji N.Efficient Extraction of Ginkgolides and Bilobalide from Ginkgo biloba Leaves[J].Journal of Natural Products，2002，65(10)：1501-1504.

[12] Zhang C X，Hu X L.Novel atoxic method of flavonoid extraction from ginkgo biloba leaves[J].Environmental Contamination and toxicology，2003，71(4)：662-667.

[13] Lang Q Y，Chien M W.Pressurized water extraction(PWE)of terpene trilactones from Ginkgo biloba leaves[J].Green Chemistry，2003，23(5)：415-420.

[14] Young H C，Jinwoong K，Pung Y.SupercriticaI-Fluid Extraction of Bilobalide and Ginkgolides from Ginkgo biloba Leaves by Use of a Mixture of Carbon Dioxide，Methanol[J].Chromatographia，2002，56(11)：753-757.

[15] Chiu K L，Cheng Y C，Chen J H.Supercritical fluids extraction of Ginkgo ginkgolides and flavonoids[J].The Journal of Supercritical Fluids，2002，24(1)：77-87.

[16] Miao S F，Yu J P，Du Z，et al.Supercritical Fluid Extraction and Micronization of Ginkgo Flavonoids from Ginkgo Biloba Leaves[J].Industrial & Engineering Chemistry Research.，2010，49(11)：5461-5466.

[17] Liang X F.Extraction Technology of Flavonoids from Ginkgo biloba L.Shells[J].Medicinal Plant，2012，3(10)：64-69.

[18] 朱兴一，谢捷，忙怡丽，等.微波辅助提取银杏叶萜类内酯的工艺研究[J].高校化学工程学报，2009，23(6)：1080-1083.

[19] Gao H，Liu B G，Nan H J.Optimization of ultrasonic-assisted extraction of flavonoids with ethanol from ginkgo leaves by response surface methodology[R].Jinan：IEEE International Symposium on，2009.

[20] 钟平，黄桂萍.超声波/微波法提取银杏叶总黄酮的对比研究[J].食品工程技术，2010，8(1)：147-148.

[21] 喻春皓，张萍，师静静.响应曲面法优化银杏叶萜内酯的纤维素酶辅助提取工艺[J].亚太传统医药，2009，5(11)：20-23.

[22] 庞允，杨建秀，刘子兰.银杏叶中黄酮的提取工艺比较[J].制剂技术，2007，16(3)：38-40.

[23] Chen S，Xing X H，Huang J J，et al.Enzyme-assisted extraction of flavonoids from Ginkgo biloba leaves：Improvement effect of flavonol transglycosylation catalyzed by Penicillium decumbens cellulose[J].Enzyme and Microbial Technology，2011，48(1)：100-105.

[24] Riera E，Golas Y，Blanco A.Mass transfer enhancement in supercriticaluids extraction by means of power ultrasound[J].Ultrasonics Sonochemistry，2004，11(4)：241-244.

[25] 李莹，周剑忠，王功，等.超声波和微波联合提取银杏叶黄酮的研究[J].食品科技，2008，33(6)：153-155.

[26] 倪林，叶明，杨必伟.微波-高压提取银杏叶黄酮工艺条件优化[J].食品与生物技术学报，2012，31(2)：199-205.

[27] 吴昊，宗志敏，石金龙.超声波协同酶法提取银杏黄酮的工艺研究[J].中国资源综合利用，2012，3(11)：26-29.

[28] Yu C H，Chen J，Xiong Y K.Optimization of multi-stage countercurrent extraction of antioxidants from Ginkgo biloba L.leaves[J].Food and Bioproducts Processing，2012，90(2)：95-101.

[29] Lang Q Y，Wai C M.An Extraction Method for Determination of Ginkgolides and Bilobalide in Ginkgo Leaf Extracts[J].Analytical Chemistry，1999，71(14)：2929-2933.

[30] Zhang J，Hayat K，Zhang X M.Separation and Purification of Flavonoid from Ginkgo Extract by Polyamide Resin[J].Separation Science and Technology，2010，45(16)：2413-2419.

[31] 李月，陈莹.大孔吸附树脂分离纯化银杏叶总黄酮的研究[J].化学与生物工程，2009，26(7)：55-57.

[32] 周芸，陶李明，何笃贵，等.聚(对乙烯基苄基脲)大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附性能[J].化学研究，2009，20(2)：90-94.

[33] Li J，Howard A C.Use of expanded bed adsorption to purify flavonoids from Ginkgo biloba[J].Journal of Chromatography A，2009，1216(50)：8759-8770.

[34] Qiu F，Brent J F，James B，et al.Design of countercurrent separation of Ginkgo biloba terpene lactones by nuclear magnetic resonance[J].Journal of Chromatography A，2012，1242(15)：26-34.

[35] Liu J，Liu R，Sun A，et al.Connection of High-Speed counter-current chromatography with evaporative light scattering detector by flow injection and its application for preparative isolation and purification of ginkgolide compounds from ginkgo biloba[J].Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies，2013，36(2)：2317-2329.

[37]Yu F C，Lai S M，Suen S Y.Extraction of Flavonoid Glycosides from Ginkgo biloba Leaves and Their Adsorption Separations Using Hydrophobic and AnionExchange Membranes[J].Separation Science & Technology，2003，38(5)：1033-1050.

StudyProgressonExtractionandSeparationTechnologyofGinkgoFlavonoidsandTerpeneLactones

SHAO Tingting*

(BaoLingPharmaceuticalCo.，Ltd.，Zhejiang，Hangzhou310018，China)

The flavonoids and terpene lactones are main active components ofGinkgobilobaleaves，which has been highly concerned because of its medicinal values.Effective extraction and separation of them has been drown attention internationally.In this paper，the main active ingredient and pharmacological effects ofGinkgobilobawere presented，the extraction and purification process of ginkgo flavonoids and terpene lactones were reviewed，the advantages and disadvantages of both technology were compared.In addition，the extraction and purification technology development trends were prospected.The results can provide references for more efficient and rational development of ginkgo extraction products.

Ginkgobiloba；flavonoids；terpene lactones；extraction；purification

2015-04-18)

*

邵婷婷，硕士，研究方向：药品与功能性食品开发；E-mail：tracy0102@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.032