高　玲　苗　军

(长春医学高等专科学校，吉林　长春　130031)



p53蛋白介导多巴胺受体激动剂阿朴吗啡对人神经母细胞瘤的抗氧化作用

高玲苗军

(长春医学高等专科学校，吉林长春130031)

摘要〔〕目的探讨p53蛋白在非选择性多巴胺受体激动剂阿朴吗啡的抗氧化作用。方法采用不同浓度过氧化氢(H2O2)诱导人神经母细胞瘤细胞侏(SH-SY5Y)细胞损伤；CellTiter-BlueTM荧光生存能力检测试剂盒测定细胞损伤程度。Western印迹检测蛋白表达变化。结果SH-SY5Y细胞经不同浓度的H2O2处理24 h后，细胞死亡率呈浓度依赖性，经0.7 mmol/LH2O2处理不同时间后，细胞死亡率具有时间依赖性；经不同浓度H2O2处理细胞6 h后，p53和p21蛋白水平呈浓度依赖性升高；0.7 mmol/L H2O2处理不同时间p53蛋白水平在1 h开始升高，6 h达高峰，以后逐渐下降但仍然保持较高水平持续至少达24 h；处理6 h后p21蛋白水平升高，持续24 h基本保持不变；APO从5～20 μm均可抑制H2O2诱导的细胞凋亡，我们确定有效的浓度是10 μm；0.7 mmol/L H2O2处理后升高的p53和p21蛋白水平被提前2 h加入的10 μm APO所抑制。结论APO通过降低p53蛋白水平实现抗氧化作用，为临床应用治疗阿尔海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化及衰老等提供实验依据。

关键词〔〕阿朴吗啡；氧化应激；p53

第一作者：高玲(1971-)，女，讲师，博士，主要从事神经生理研究。

氧化应激在神经系统变性疾病中发生神经细胞功能障碍和死亡的最重要原因之一。阿尔茨海默病(AD)〔1〕、帕金森病〔2〕、肌萎缩侧索硬化〔3〕、衰老〔4〕和许多其他神经细胞功能障碍和缺失疾病中都存在过氧化与抗氧化失平衡，最终导致神经细胞损伤。过氧化氢(H2O2)通过产生羟基而引起DNA、蛋白质和细胞膜损伤〔5〕产生细胞毒性。阿朴吗啡(APO)是一个强有力的非选择性多巴胺受体激动剂，可以激活所有的多巴胺受体亚型。目前用于治疗帕金森病是由于APO啡可以促进几种生长因子的合成〔6,7〕。亦有报道显示，APO在低浓度时具有抗氧化作用，在高浓度时具有细胞毒性〔8〕，其抗氧化作用可能不是通过受体介导的〔9〕。P53为肿瘤抑制基因。在控制细胞周期、细胞凋亡、基因组稳定性、抑制血管新生等方面扮演重要角色。已有研究表明，p53在AD〔10〕动物模型和AD患者脑中明显升高，这与海马神经元的凋亡有直接关系。APO的抗氧化中是否通过诱导p53蛋白的表达一直未有报道。本研究通过APO抑制H2O2诱导产生的细胞凋亡，分析低浓度的APO的抗氧化作用机制。

1材料与方法

1.1细胞培养人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液培养。细胞置于37℃、含5%二氧化碳潮湿空气的温箱中。

1.2细胞生存率实验细胞生存率用CellTiter-BlueTM荧光生存能力检测试剂盒测定。所有细胞死亡的测定结果均通过倒置显微镜观察得到证实。CellTiter-BlueTM荧光生存能力检测试剂盒以刃天青作为指示剂。培养在24孔培养皿中的细胞吸去培养基，将100 ml CellTiter-BlueTM试剂加入500 ml DMEM培养基后加入培养皿，在37℃孵育1 h，培养基转移到96孔培养皿中，培养基的荧光强度用荧光分析仪(MTP800 AFC Microplate-Reader;Corona Electric Japan,东京，日本)测定，测定参数为激发波长560 nm，发射波长590 nm，未经任何处理的培养基荧光强度作为基础参照。所有实验均重复6次以上。

1.3蛋白质印迹检测p53蛋白、p21蛋白细胞用2%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液裂解后蛋白质浓度用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce,Rockford,IL,美国)测定。电泳时每个样品上样10 μg，蛋白质经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到PVDF膜上(Millipore,Bedford,MA,美国)，用TBS-T溶液(25 mmol/L Tris-HCl pH7.6,150 mmol/L NaCl,0.1% Tween-20)制成的5%脱脂牛奶封闭无蛋白部分后，PVDF膜孵育在抗p53单克隆抗体(1∶1 000 dilution;DO-1;Santa Cruz,CA,美国)，抗p21单克隆抗体(1∶1 000 dilution;187;Santa Cruz;CA,美国)和抗α-actin单克隆抗体(1∶4 000 dilution;AC-15;Sigma,SL,美国)中常温下过夜，用TBS-T溶液反复清洗后室温下孵育在相应的二抗溶液中1 h，并在ECL 化学发光检测系统(Amersham Bioscience,Piscataway,NJ,美国)中显示目标蛋白条带。

1.4苏木精-伊红染色载玻片上培养的细胞用冷PBS清洗后用95%乙醇在室温下固定10 min，用苏木精染色40 s，流水清洗后用伊红染色1 min，再用流水清洗后用酒精脱水，用二甲苯清除残存的酒精后盖上盖玻片，显微镜下摄取图像。

1.5统计学方法应用StatView软件进行双因子方差分析。

2结果

2.1H2O2诱导的浓度和时间依赖性细胞死亡与p53蛋白的关系不同浓度的H2O2作用于SH-SY5Y 24 h后，细胞死亡率随H2O2浓度增加而增大；选用0.7 mmol/L H2O2，随培养时间的延长细胞死亡率增加，见图1。

不同浓度的H2O2处理SH-SY5Y细胞6 h后，测定到p53和p21蛋白水平随H2O2的浓度增加而升高，并与p53和p21蛋白表达呈正相关。同时，用0.7 mmol/L H2O2处理SH-SY5Y细胞，经不同时间点后测定，p53蛋白水平在处理后1 h开始升高，6 h达高峰，以后逐渐下降但仍然保持高位持续至少达24 h。H2O2处理6 h后p21蛋白水平升高，一直持续24 h基本保持不变，见图1。

2.2APO抑制H2O2诱导的细胞死亡与p53和p21蛋白的关系本实验应用的APO的浓度(5～20 μmol/L)没有引起细胞死亡，且提前应用APO可以有效降低H2O2诱导的细胞死亡，最以10 μmol/L的APO效果明显。0.7 mmol/L的H2O2培养24 h导致大约50%的细胞死亡，细胞生存率实验显示提前2 h应用10 μmol/L的APO可以完全逆转H2O2引起的细胞死亡。HE染色清楚地显示0.7 mmol/L H2O2导致的细胞死亡完全被提前应用10 μmol/L的APO所抑制。而且，提前2 h应用10 μmol/L APO处理的细胞加入0.7 mmol/L H2O2，经6 h后测定p53和p21蛋白水平，显示0.7 mmol/L H2O2处理6 h后升高的p53和p21蛋白水平也被阿朴吗啡所抑制，见图2。

A、B：不同浓度H2O2处理24 h后细胞生存率；C、D：0.7 mmol/L H2O2处理经不同时间点测定细胞生存率图1　在SH-SY5Y细胞中H2O2诱导的浓度依赖性和时间依赖性细胞死亡

A：细胞提前2 h不同浓度APO处理后，加入不同浓度H2O2 24 h后细胞生存率；B：10 μmol/L APO处理2 h加入0.7 mmol/L H2O2 24 h后细胞生存率；C：HE染色图2　SH-SY5Y细胞中APO抑制H2O2诱导的细胞死亡并下调H2O2处理后增高的p53和p21蛋白水平

3讨论

p53作为一个转录因子，参与细胞周期的调节、DNA的修复以及细胞凋亡的启动。p53位于一个巨大的蛋白质网络中心，整合不同来源的信号。细胞处于应激状态时，如DNA损伤或癌基因表达，可以导致整个网络的激活。激活后的p53与特定DNA启动子的相应序列结合，诱导下游目标基因转录。这些基因的蛋白质产物启动DNA修复机制，如果修复失败就产生程序细胞死亡。所以当细胞处于应激状态下p53可以通过阻止细胞进入细胞周期而抑制细胞增殖，在很多情况下甚至导致细胞凋亡。p21是p53的一个重要的下游基因〔9〕。

本研究说明H2O2诱导产生的氧化应激状态激活了p53网络。p53蛋白水平升高发生在过氧化氢处理后1 h，而作为p53的下游基因，p21的蛋白水平在过氧化氢处理6 h以后才开始增加。p53和p21蛋白水平升高之间的时间差说明p21蛋白增加继发于p53蛋白升高。增高的p53蛋白与p21基因的启动子结合，诱导p21信使RNA转录以及蛋白质的合成，同时还有其他p53下游基因的转录和翻译，产生一系列蛋白质产物，从而启动程序细胞死亡，最终导致细胞凋亡。

左旋多巴仍然是治疗帕金森病的金标准。然而，大多数患者在治疗几年后出现左旋多巴相关的运动障碍，最终造成患者残疾。多巴胺受体激动剂的应用可能产生更好的远期效果。APO作为非选择性多巴胺受体激动剂可以直接刺激突触后膜的多巴胺受体改善帕金森症状。APO的作用机制目前还不十分明了。已知APO可以抑制过度的细胞凋亡，降低过度产生的一氧化氮，从而作为强抗氧化剂改善多巴胺能神经元的功能〔11〕。APO可以保护细胞免受氧化应激诱导剂，如过氧化氢、6-羟基多巴胺〔8〕和谷氨酸〔12〕等产生的氧化应激损伤。抑制早期的氧化损伤对于阿朴吗啡的抗氧化作用至关重要。另外APO是通过下调p53蛋白的表达实现其抗氧化作用，从而为帕金森病的预防和合理治疗提供了科学依据。

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〔2014-11-29修回〕

(编辑李相军/滕欣航)

通讯作者：苗军(1971-)，男，副主任药师，主要从事临床药理应用与研究

基金项目：吉林省教育厅科研课题(2014606)

中图分类号〔〕R73〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6054-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.021