刘东慧　王小杰　宋成军　陈志宏

(承德医学院人体解剖学教研室，河北　承德　067000)



2型糖尿病大鼠肝脏肿瘤坏死因子-α表达变化及丝胶的保护作用

刘东慧王小杰1宋成军陈志宏

(承德医学院人体解剖学教研室，河北承德067000)

摘要〔〕目的研究2型糖尿病大鼠肝脏肿瘤坏死因子(TNF)-α表达的变化及丝胶的保护作用。方法雄性SD大鼠48只，随机分为正常对照组、模型组、丝胶治疗组及阳性对照组，每组12只。链脲佐菌素连续腹腔注射法制备2型糖尿病大鼠模型，成功后模型组大鼠不做处理，丝胶治疗组大鼠给予2.4 g·kg-1·d-1剂量的丝胶灌胃35 d，阳性对照组大鼠给予55.33 mg·kg-1·d-1剂量的二甲双胍灌胃35 d。采用SP免疫组化法、蛋白免疫印迹法和RT-PCR法检测各组大鼠肝脏TNF-α的表达情况。 结果与正常对照组大鼠相比，TNF-α蛋白和mRNA在糖尿病模型组大鼠肝脏中均呈高表达(P<0.01)；与模型组大鼠相比，TNF-α蛋白和mRNA在丝胶治疗组、阳性对照组大鼠肝脏中均呈低表达(P<0.01)。结论丝胶可能通过下调肝脏TNF-α的表达改善胰岛素抵抗。

关键词〔〕丝胶；2型糖尿病；肝脏；肿瘤坏死因子-α

1承德医学院基础医学研究所

第一作者：刘东慧(1987-)，女，硕士，主要从事糖尿病及其并发症防治研究。

研究发现，介导炎症的细胞因子，如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、C反应蛋白等与胰岛素抵抗密切相关；这些细胞因子介导的炎症反应亦与非酒精性脂肪性肝病的发生发展密切相关〔1〕。其中，TNF-α是一种多功能细胞因子，以肝脏为重要的靶器官，主要来源于脂肪组织的巨噬细胞，可在感染、恶性肿瘤、烧伤等状态下诱发机体产生胰岛素抵抗〔2〕。本课题组的前期研究已经发现，彩色蚕茧水提物丝胶蛋白(简称丝胶)能明显降低2型糖尿病(T2DM)大鼠的血糖，但具体机制尚不清楚。本研究拟探讨丝胶是否通过影响肝脏TNF-α的表达发挥降血糖的作用。

1材料与方法

1.1实验用大鼠、药品和试剂清洁级雄性SD大鼠48只，合格证号712024，体质量200～250 g，购自河北医科大学实验动物学部。丝胶(自制)：由承德医学院桑蚕研究所提供彩色蚕茧，蚕茧浸泡、水煎2次后合并滤液，浓缩至所需浓度。链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司；TNF-α兔抗大鼠多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；SP免疫组化试剂盒、DAB显色液，武汉博士德生物工程有限公司；小鼠抗β-actin单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；二抗(山羊抗兔IgG)，美国KPL公司；蓝色预染蛋白质分子量标准(低)，北京泰格美科技有限公司；Trizol，美国Invitrogen公司；TNF-α引物，上海生工生物工程有限公司；RT-PCR试剂盒、100 bp DNA Ladder，北京天根生化科技有限公司。

1.2实验动物分组、模型的建立和给药48只大鼠随机分为①正常对照组，12只，大鼠常规饲养，不做处理。②糖尿病模型组，12只，建立T2DM大鼠模型后不做处理。建立模型的方法：2%STZ(25 mg/kg)每天一次连续腹腔注射3d，注射STZ后7 d以空腹血糖≥16.7 mmol/L作为模型成功建立的标准。③丝胶治疗组，12只，按上述方法成功建立T2DM大鼠模型后按2.4 g/kg的剂量给予丝胶灌胃35 d(1次/d)。④阳性对照组，12只，按上述方法成功建立2型糖尿病大鼠模型后按55.33 mg/kg的剂量给予二甲双胍灌胃35天(1次/d)。

1.3取材和指标检测采用4%水合氯醛腹腔注射的方式麻醉，以毛细玻璃管插入大鼠内眦取血，离心后取上部血清，采用葡萄糖氧化酶法检测血糖水平。大鼠取血后处死，取肝脏，一部分入固定液Bouins液中固定，一部分用液氮速冻后放于-80℃冰箱保存。

1.4肝脏TNF-α蛋白表达的检测

1.4.1免疫组织化学染色及定量分析Bouins液固定肝脏常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片。采用SP免疫组化法，一抗稀释浓度为1∶50，阴性对照为PBS代替一抗，以细胞质中出现棕黄色颗粒至棕褐色颗粒为阳性细胞标志。每组随机选取12张切片，每张切片在10×40倍显微镜下选取肝脏视野，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对TNF-α阳性产物的IOD值进行定量分析。

1.4.2免疫印迹法取30 mg保存的肝脏组织匀浆提取蛋白，蛋白浓度的确定使用二喹林甲酸蛋白定量试剂盒。8%积层胶和12%分离胶电泳，蛋白上样量100 μg，4℃、2 mA/cm2转膜2h，5%脱脂奶粉封闭过夜，TNF-α 1∶100稀释、β-actin 1∶1 000稀释一抗室温孵育2h，二抗(1∶5 000)孵育1 h，Super ECL Plus超敏发光液显影。扫描胶片，显影条带的分析使用Quantity One 4.6.2软件，TNF-α蛋白的相对表达水平以TNF-α目的条带和β-actin条带的灰度比值计。

1.5RT-PCR法检测肝脏TNF-α mRNA的表达在液氮中将100 mg肝脏碾磨成粉末，加入Trizol后提取肝脏的总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳确定所提取总RNA的完整性。以3 μg总RNA为模板反转录成cDNA，反应条件：42℃孵育3 min；加入反应液Mix，42℃孵育15 min；99℃反应3 min。PCR反应条件：94℃，2 min；94℃，30 s；57℃，30 s；72℃，1 min，第2步起循环。PCR引物序列及扩增条件见表1。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用ZF型紫外透射反射分析仪摄片，应用Quantity One 4.6.2软件进行定量分析，以目的条带与β-actin条带吸光度比值为TNF-α mRNA的相对表达水平。

表1　PCR引物序列及扩增条件

1.6统计学分析采用SPSS19.0软件，组间计量资料的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2结果

2.1各组大鼠血糖水平模型组大鼠的血糖(29.45±4.82) mmol/L，明显高于正常对照组(10.83±2.03) mmol/L(P<0.01)；丝胶治疗组、阳性对照组大鼠的血糖水平分别为(13.20±4.09) mmol/L、(13.20±2.30) mmol/L，明显低于模型组(P<0.01)。

2.2大鼠肝脏TNF-α的表达免疫组化结果显示，TNF-α蛋白免疫产物为棕黄色和棕褐色颗粒状，位于肝细胞的细胞质(图1)。与正常对照组大鼠比较，模型组大鼠肝脏TNF-α蛋白和mRNA的表达明显升高(P<0.01)；丝胶治疗组、阳性对照组大鼠肝脏TNF-α蛋白和mRNA的表达较模型组明显降低(P<0.01)。见图2、图3、表2。

图1　大鼠肝脏TNF-α蛋白表达(免疫组织化学染色，×400)

1：正常对照组，2：模型组，3：丝胶治疗组，4：阳性对照组；下表同图2　蛋白印迹法检测大鼠肝脏TNF-α蛋白表达

图3　RT-PCR法检测大鼠肝脏TNF-α mRNA的表达

组别蛋白免疫组化法蛋白印迹法mRNA正常对照组0.325±0.0131)0.403±0.0321)0.502±0.0131)模型组0.541±0.0090.677±0.0520.867±0.032丝胶治疗组0.441±0.0071)0.594±0.0461)0.631±0.0181)阳性对照组0.421±0.0031)0.570±0.0441)0.630±0.0171)

与模型组比较：1)P<0.01

3讨论

糖尿病是一种因体内胰岛素分泌相对或绝对不足引起的以糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱为特征的慢性内分泌代谢性疾病〔3〕。其中，T2DM还是一种先天性免疫和慢性炎症性疾病，炎症细胞因子在T2DM的发病中发挥重要作用〔4，5〕。TNF-α是参与炎症反应的重要因子，参与机体的多种病理生理改变，分泌过量时可造成多脏器损伤〔6〕；另外，TNF-α与胰岛素抵抗以及胰岛素引起的相关疾病密切相关，并且能较好地反映胰岛素抵抗的程度〔7，8〕。TNF-α致胰岛素抵抗的作用机制包括：①TNF-α通过抑制胰岛素受体底物-1的酪氨酸磷酸化，导致激活下游磷酸肌醇激酶-3的能力下降，从而减弱胰岛素的信号传导；使葡萄糖转运蛋白(GLUT)-4的表达减少，抑制胰岛素刺激的葡萄糖转运〔9〕。②通过促进脂肪细胞的脂肪分解及FFA的释放，参与介导了肝及外周组织的胰岛素抵抗〔4〕。③TNF-α还能降低PPARγ mRNA表达，减少PPARγ的产生引起胰岛素抵抗〔10〕。本课题组的前期研究发现，糖尿病模型组大鼠出现了明显的胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱〔11〕。本研究结果亦显示，糖尿病模型组大鼠肝脏TNF-α蛋白和mRNA的表达水平升高，与上述理论机制相符合。

丝胶约占蚕茧的25%～30%，在缫丝提取丝素时作为废料丢弃，不仅造成巨大浪费，也造成了环境污染。本研究根据《本草纲目》记载的“蚕茧能煮水治消渴”以及民间蚕茧泡水降血糖的验方，提取了蚕茧中溶于水的高分子蛋白——丝胶。且前期研究发现，丝胶对T2DM大鼠血糖升高和血脂代谢紊乱具有明显的改善和预防效果，且能有效保护胰岛细胞损伤〔11,12〕。本研究显示，丝胶能明显降低T2DM大鼠肝脏TNF-α和HNF-4α的表达，提示丝胶可能通过影响TNF-α的表达改善胰岛素抵抗，可能是丝胶降血糖、发挥抗糖尿病效应的机制之一。

参考文献4

1Matafome P,Louro T,Rodrigues L,etal.Metformin and atorvastatin combination further protect the liver in type 2 diabetes with hyperlipidaemia〔J〕.Diabetes Metab Res Rev,2011；27(1):54-62.

2徐丽英，何伟峰，梁小仲.TNF-α与肝源型糖尿病的相关性研究〔J〕.中国现代药物应用，2013；11(7)：78-80.

3赵大鹏，隋艳波，栾仲秋，等.洋参御糖方对糖尿病大鼠糖脂代谢的干预作用〔J〕.中医药信息，2013；30(2)：44-5.

4陈红，孙明杰，彭娟，等.黄连解毒汤对糖尿病大鼠肝脏核因子-κB、肿瘤坏死因子-α表达的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2010；16(18)：153-6.

5Esser N,Legrand-Poels S,Piette J,etal.Inflammation as a link between obesity,metabolic syndrome and type 2 diabetes〔J〕.Diabet Res Clin Pract,2014；105(2):141-50.

6Lopez-Font I,Gea-Sorlí S,de-Madaria E,etal.Pancreatic and pulmonary mast cells activation during experimental acute pancreatitis〔J〕.World J Gastroenterol,2010；16(27):3411-7.

7向静，王宁，阿布力克木·吐尔地.炎症因子与小鼠肝脏胰腺胰岛素抵抗的相关研究〔J〕.新疆医科大学学报，2011；34(1)：5-8.

8Rigamonti AE,Agosti F,De Col A,etal.Severely obese adolescents and adults exhibit a different association of circulating levels of adipokines and leukocyte expression of the related receptors with insulin resistance 〔J〕.Int J Endocrinol,2013；2013:565967.

9王占科，柴长春，冯青青，等.TNFα对正常昆明小鼠骨骼肌和肝脏葡糖糖摄取的影响〔J〕.中国实验动物学报，2005；13(4)：227-30.

10Miles PD,Romeo OM,Higo K,etal.TNF-alpha-induced insulin resistance in vivo and its prevention by troglitazone〔J〕.Diabetes,1997；46(11):1678-83.

11付秀美，钟美蓉，付文亮，等.丝胶对2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(1)：103-5.

12李健，钟美蓉，宋成军，等.丝胶对2型糖尿病大鼠坐骨神经神经微丝蛋白表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(5)：1326-7.

〔2015-02-10修回〕

(编辑李相军)

Changes of tumor necrosis factor-α expression in liver of type 2 diabetes mellitus rats and protective actions of sericin

LIU Dong-Hui,WANG Xiao-Jie,SONG Cheng-Jun,etal.

Department of Human Anatomy,Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei， China

【Abstract】ObjectiveTo study the change of tumor necrosis factor(TNF)-α expression in liver of type 2 diabetes mellitus(T2DM) rats and protective actions of sericin.Methods48 male SD rats were randomly divided into normal control,diabetes model,sericin treatment and positive control groups(n=12).The rats in model group were not given any more treatments,the rats in sericin treatment group were lavaged with sericin (2.4 g·kg-1·d-1) for 35 d,the rats in positive control group were lavaged with metformin (55.33 mg·kgspan·d-1) for 35 d.SP immunohistochemical stain,Western blot and RT-PCR were used to detect TNF-α protein and mRNA expressions in liver.ResultsCompared with those in normal control group,the TNF-α protein and mRNA expressions in liver of rats in model group were increased obviously (P<0.01).Compared with those in model group,the TNF-α protein and mRNA expressions in liver of rats in sericin treatment and positive control groups were decreased obviously (P<0.01).ConclusionsSericin might improve insulin resistance by down regulating TNF-α expression in liver.

【Key words】Sericin; Type 2 diabetes mellitus; Liver; Tumor necrosis factor-α

通讯作者：陈志宏(1971-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事糖尿病及其并发症防治研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(81441133)；河北省自然科学基金项目(p013406096)

中图分类号〔〕R587.1〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6011-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.004