全自动ELISA系统检测抗线粒体M2抗体及临床意义

高滴度的抗线粒体M2抗体是原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)的诊断标志性自身抗体。有文献报道，抗线粒体M2抗体在PBC患者出现临床症状和组织学特征变化之前数年即可出现，其在PBC诊断及疾病预测等方面具有重要价值[1]。有研究已证明，抗线粒体M2抗体的靶抗原主要为线粒体上的2-氧酸脱氢酶复合体(2-oxoacid dehydrogenase complex， 2-OADC)的一些组分，即侧链2-氧酸脱氢酶复合体E2(E2 subunit of the branched-chain 2-oxoacid dehydrogenase complex， BCOADC-E2)、丙酮酸脱氢酶复合体E2(E2 component of pyruvate dehydrogenase complex， PDC-E2)、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2 (E2 subunit of the oxoglutarate dehydrogenase complex， OGDC-E2)[2-3]。目前，抗线粒体M2抗体的检测试剂主要针对以上3种靶抗原的组合蛋白，检测方法以手工酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)为主，而且没有统一的单位值。我们从多年的临床检验中发现，该抗体低水平阳性也常常见于其他肝病或其他自身免疫性疾病，给临床诊断与鉴别诊断带来困惑。鉴于以上问题，本研究采用全自动ELISA系统对PBC、慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染者和健康对照组267例样本进行抗线粒体M2抗体检测，避免或减少手工操作不规范及其他因素引起的不可靠结果，加强质量管理，以达到辅助临床诊断和鉴别诊断的目的。

材料和方法

一、研究对象

选取2010年1月至2013年7月于首都医科大学附属北京佑安医院住院患者189例，其中PBC组112例， 男11例，女101例，年龄(56.64±11.57)岁； HBV感染组77例，男56例，女21例，年龄(41.4±13.1)岁。78名来自首都医科大学附属北京佑安医院输血科的健康献血员作为健康对照组，男48名，女30名，年龄(33.8±9.7)岁。PBC采用2009年美国肝脏病学会(American Association for the Study of Liver Diseases ， AASLD)推荐的诊断建议[4]。HBV感染者诊断标准符合“慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)”[5]。所有患者早晨空腹采集静脉血3 mL，1 h内分离血清，-20 ℃保存至检测。

二、试剂与仪器

1.试剂抗线粒体M2抗体检测试剂盒(ELISA，上海科新生物技术股份有限公司)。

2.仪器ADC ELISA 400流水线式全自动酶联免疫工作站(山东艾德康生物有限公司)。

三、方法

2.全自动ELISA系统检测抗线粒体M2抗体 将试剂和检测样本置于全自动酶联免疫工作站相应的位置。按照试剂盒的操作要求，先将试剂盒平衡至室温。将待检血清用样本稀释液按1∶200的比例稀释。加样本：分别向孔中加入100 μL不同浓度的标准品S1-S5(浓度分别为800、200、100、50和25 RU/mL)、阳性对照品、阴性对照品和稀释后的待检血清，加完最后一个样本后开始计时，室温温育30 min。洗板：每孔加入应用洗涤液400 μL，洗涤液在孔中保留1 min，洗涤3次，每孔加酶标抗体工作液100 μL，室温温育30 min，重复洗板3次。显色：将显色液A、显色液B以1∶1等体积混合，重复混匀后每孔加入100 μL混合液，混匀，室温避光显色15 min，每孔加入50 μL终止液。在终止反应20 min内，于450和630 nm双波长测量各孔的吸光度(A)值。分别以S1-S5标准品浓度的自然对数和其A值为横、纵坐标，作标准曲线，并根据标准曲线计算患者血清中的抗体浓度。临界值为25 RU/mL，线性检测范围为25～800 RU/mL。

四、统计学方法

结果

一、全自动ELISA系统检测抗线粒体M2抗体的精密度评估

批内和天间的不精密度结果见表1。该ELISA系统的批内和天间精密度均较好，CV均≤5%。同时我们评价了该全自动酶联免疫工作站单通道、多通道针对不同浓度样本、标准品和不同取样量的结果均一性，CV均≤5%(具体数据未显示)。

表1　全自动ELISA系统检测抗线粒体M2抗体的精密度评估结果

二、抗线粒体M2抗体对PBC诊断的ROC曲线和诊断特性参数

绘制的抗线粒体M2抗体对PBC诊断的ROC曲线见图1。当临界值定为25 RU/mL时，敏感性为89.3%，特异性为94.8%，阳性预测值为92.6%，阴性预测值为92.5%，阳性似然比为17.2，阴性似然比为0.11，曲线下面积为0.980，故认可试剂生产商提供的抗线粒体M2抗体的阳性判断限25 RU/mL。

图1　抗线粒体M2抗体对PBC诊断的ROC曲线

三、抗线粒体M2抗体在不同组别中的分布情况

PBC组抗线粒体M2抗体的阳性率为89.3%(100/112)，抗体浓度>800 RU/mL的比例为63%(71/112)，抗体浓度在25～50 RU/mL的比例为3%(3/112)。HBV感染组抗线粒体M2抗体的阳性率为5.2%(4/77)，4例抗体阳性者中有3例抗体浓度在25～100 RU/mL之间，1例在100 RU/mL以上；健康对照组抗线粒体M2抗体阳性率为5.1%(4/78)，4例抗体阳性者抗体浓度在25～50 RU/mL之间(数值分别为26.6、28.8、34.3和26.5 RU/mL)。见表2和图2。

表2　抗线粒体M2抗体在不同组别中的阳性率

注：(a)为PBC组；(b)为HBV感染组；(c)为健康对照组

图2PBC组、HBV感染组和健康对照组抗线粒体M2抗体不同浓度的分布情况

讨论

本研究采用全自动ELISA系统，以重组PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2的组合蛋白为靶抗原，检测抗线粒体M2抗体。我们首先对该系统的精密度进行了评估，对不同浓度样本和标准品进行了检测，批内和天间的CV均≤5%，精密度较好。抗线粒体M2抗体是PBC患者最为特征性的血清标志物，对PBC具有诊断价值[6-8]。

本研究检测了112例PBC患者、77例HBV感染者和78名健康对照者血清中的抗线粒体M2抗体，PBC患者抗线粒体M2抗体检测的阳性率为89.3%，与YANG等[9]报道的阳性率89%一致。PBC患者抗线粒体M2抗体以高滴度为主，抗体浓度>800 RU/mL的比例为63%(71/112)。 本研究中发现4例HBV感染者抗线粒体M2抗体阳性，阳性率为5.2%(4/77)，其中3例抗体浓度值在25～100 RU/mL之间， 1例在110 RU/mL以上，临床诊断为慢性乙型肝炎合并戊型肝炎，而且此患者抗核抗体低滴度阳性，但是否对抗线粒体M2抗体的检测有影响，有待进一步研究。健康对照组抗线粒体M2抗体阳性率为5.1%(4/78)，4例抗体阳性者抗体浓度在25～50 RU/mL之间，浓度值分别为26.6、28.8、34.3和26.5 RU/mL，抗体浓度值多集中在25～30 RU/mL。在本研究中对照组为健康献血员，在献血时并未检测抗线粒体M2抗体，也没有出现任何临床症状和体征。因此，如果偶然发现这种抗体存在，而无临床表现，应评估该抗体对该个体预后的影响，并结合患者的年龄、性别、临床其他相关疾病及其他实验室指标综合评价。由于抗线粒体M2抗体可出现在临床表现前，并对疾病具有一定的预测价值，因此必要时可进行定期复诊及实验室指标检测。

我们从多年的临床检验中发现抗线粒体M2抗体低水平(25～40 RU/mL)阳性也常常见于其他肝病，给临床诊断与鉴别诊断带来困惑。可能有以下原因：(1)疾病本身特点；(2)缺乏国际参考物质，目前尚未标准化；(3)检测项目本身的参考区间是否合适；(4)检测系统的问题。本研究结果发现在HBV感染者和健康对照者中处于低水平抗线粒体M2抗体阳性的比例约为5%，较手工检测的比例低，说明全自动ELISA系统较手工法有一定的优点，可适当排除一些非特异因素，减少了一些临界值上下的数值，提高了试验数据的稳定性和可靠性。但后续工作中仍需要我们扩大样本量进行验证，才能为PBC的诊断和鉴别诊断提供更有价值的实验室依据。

参考文献

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[4]LINDOR KD， GERSHWIN ME， POUPON R， et al. Primary biliary cirrhosis [J]. Hepatology， 2009， 50(1) : 291- 308.

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(本文编辑：姜敏)

张海萍，闫惠平，张欣，赵丹彤，马胤雪，孙丽梅，李卓敏

(首都医科大学附属北京佑安医院，北京 100069)

摘要：目的使用全自动酶联免疫吸附试验(ELISA)系统检测抗线粒体M2抗体并探讨其临床意义。方法收集267例血清样本，包括112例原发性胆汁性肝硬化患者(PBC)、77例乙型肝炎病毒(HBV)感染者和78名健康对照者血清样本，使用全自动ELISA系统检测抗线粒体M2抗体，评估该系统检测抗线粒体M2抗体的精密度和抗线粒体M2抗体的临床价值。结果全自动ELISA系统的精密度较好，批内和天间的变异系数(CV)均<5%。PBC患者抗线粒体M2抗体的阳性率为89.3%(100/112)，抗体浓度值以大于800 RU/mL为主(63%， 71/112)。HBV感染者抗线粒体M2抗体的阳性率为5.2%(4/77)，3例抗体浓度值在25～100 RU/mL之间，1例在100 RU/mL以上；健康对照组中抗线粒体M2抗体阳性率为5.1%(4/78)，4例抗体阳性者抗体浓度值均在25～50 RU/mL之间。结论抗线粒体M2抗体ELISA检测的系统化保证了检验结果的稳定性，可为PBC的诊断和与其他肝病的鉴别诊断提供更有价值的实验室依据。

关键词：抗线粒体M2抗体；原发性胆汁性肝硬化；酶联免疫吸附试验

Automatic ELISA system for the detection of anti-mitochondrial M2 antibody and its clinical significanceZHANGHaiping，YANHuiping，ZHANGXin，ZHAODantong,MAYinxue,SUNLimei,LIZhuomin.(BeijingYouanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

Abstract:ObjectiveTo detect anti-mitochondrial M2 antibody by automatic enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) system and to investigate its clinical significance. MethodsA total of 267 serum samples[(112 samples from patients with primary biliary cirrhosis (PBC)， 77 samples from patients infected with hepatitis B virus (HBV)and 78 samples from healthy controls] were detected for anti-mitochondrial M2 antibody by automatic ELISA system. The precision and the clinical significance of detecting anti-mitochondrial M2 antibody were evaluated. ResultsThe precision was good .The within-run and inter-day coefficients of variation(CV) were <5%. The patients with PBC had positive rate 89.3% (100/112) for anti-mitochondrial M2 antibody， usually in high levels (>800RU/mL, 63%, 71/112). The positive rate of anti-mitochondrial M2 antibody was 5.2%(4/77)in patients with HBV infection, including 3 cases of 25-100 RU/mL and 1 case of >100 RU/mL, and it was 5.1%(4/78)in healthy subjects. ConclusionsAutomatic ELISA system for the detection of anti-mitochondrial M2 antibody guarantees the stability of results. It will provide valuable laboratory reference for the diagnosis of PBC and the differential diagnosis for other liver diseases.

Key words:Anti-mitochondrial M2 antibody; Primary biliary cirrhosis；Enzyme-linked immunosorbent assay

收稿日期：(2015-02-28)

通讯作者：闫惠平，联系电话：010-83997348。

作者简介：张海萍，女，1981年生，硕士，助理研究员，主要从事肝病免疫研究。

基金项目：卫生计生委医药卫生科技发展研究中心资助项目(28-5-5)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)12-1234-04R446.61

文献标志码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.017