许晓峰，　江铭磊，　卢仁泉，　邹淳缘，　龚志赟，　沈　利，　郭　林



化学发光免疫分析法检测抗TP抗体S/CO比值与确证试验阳性的相关性研究

许晓峰1，江铭磊2，卢仁泉2，邹淳缘2，龚志赟2，沈利1，郭林2

梅毒是由梅毒螺旋体(treponema pallidum, TP)引起的一种慢性全身性性传播疾病，临床上诊断TP感染通常检测抗TP特异性抗体，国内常用的初筛试验包括TP颗粒凝集试验(treponema pallidum particle agglutination assay，TPPA)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay，CLIA)等，上述方法检测抗TP抗体均存在一定的假阳性和假阴性[1]，但国内不少实验室将初筛结果直接报告给临床和患者，其中的假阳性结果会给受检者带来不必要的就医和心理伤害。目前，已有更多的学者建议将免疫印迹法(western blotting，WB)作为梅毒血清学诊断的确证试验[2], 但考虑检测成本和工作量，目前难以实行对每份筛查阳性的样本均进行确证试验。本研究探讨2种CLIA系统测得的呈阳性反应样本的信号/临界值(signal-to-cut off,S/CO)比值与WB结果的相关性，初步确定既能使筛查结果具有高阳性率，又减少需进行确证试验样本数的S/CO比值。

材料和方法

一、一般资料

208份经Abbott i2000 CLIA系统(简称Abbott i2000)或科美东雅Chemclin 600 CLIA系统(简称Chemclin 600)检测抗TP抗体 S/CO比值≥1.0的血清样本采集于2012年6月至2014年7月间复旦大学附属肿瘤医院普通住院患者，男106例，女102例，年龄31～82岁。上述样本均在空腹条件下采集。静脉血5 mL，3 000×g离心10 min，分离血清。-20 ℃条件下保存待测。

二、仪器和试剂

CLIA检测抗TP抗体采用雅培公司Abbott i2000(美国)、北京科美东雅公司Chemclin 600及其配套试剂； WB试剂盒为德国欧蒙医学实验试剂公司产品。

三、抗TP抗体初筛试验呈阳性反应的判断限

Abbott i2000和Chemclin 600抗TP抗体初筛试验呈阳性反应的判断限均为S/CO比值≥1.0。

四、WB确证试验

欧蒙TP-IgG-WB试剂膜条带有6条，膜条上编号上部的黑色条带为对照调整线，编号下部的黑色条带为质控条带，中间有4条特异抗原条带，分别为TpN47、TpN45、TpN17和TpN15，非特异的抗原条带p22。结果判断：阳性对照模板上的批号必须与膜条上的批号一致，质控带出现强的颜色反应，结果有效。WB条带阳性结果判读：无特异抗原带显色为阴性,1条特异抗原带显色为可疑，2条及2条以上特异抗原带显色为阳性。

五、统计学方法

采用SPSS 19．0软件进行统计分析，用抗TP抗体S/CO比值绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，确定抗TP抗体筛查试验敏感性和特异性最佳时的S/CO比值。

结果

一、 CLIA系统抗TP抗体筛查结果比较

在208份样本中，Abbott i2000抗TP抗体筛查呈阳性反应(S/CO比值≥1.0)的血清样本193份，Chemclin 600抗TP抗体筛查呈阳性反应(S/CO比值≥1.0)的血清样本196份，2个系统筛查结果符合率为87.02 %(181/208)。见表1。

表1　2个CLIA系统抗TP抗体筛查结果比较

二、Abbott i2000和Chemclin 600抗TP抗体筛查结果与WB确证试验结果的比较

1. CLIA系统筛查抗TP抗体与WB的符合率Abbott i2000检测抗TP抗体S/CO比值≥1.0的血清样本208份，呈阳性反应的193份中去除WB不确定的42份，筛查阴性的15份中去除WB不确定的3份，Abbott i2000检测抗TP抗体筛查结果与WB的符合率为82.2%[(125+9)/(125+26+9+3)] ；Chemclin 600检测抗TP抗体S/CO比值≥1.0的血清样本208份，呈阳性反应的196份中去除WB不确定的42份，筛查阴性的12份中去除WB不确定的3份，Chemclin 600检测抗TP抗体筛查结果与WB的符合率为82.8%[(127+8)/(127+27+1+8)]。见表2。

按ALTER等[3]在美国疾病预防控制中心拟定的“抗HCV的实验室检测和结果报告指南”中对WB确证试验“不确定”结果的解释，在排除检测对象处于血清转换过程的前提下，在低感染率人群中，WB“不确定”结果提示筛查试验的结果为假阳性，而本研究未能对WB“不确定”的样本在1个月后重复取样作WB或核酸检测，因而不排除在WB结果“不确定”的样本中，经重复取样检测结果与筛查试验结果不一致所导致的符合率降低。

表2　CLIA系统抗TP抗体筛查结果与WB结果比较

2. WB确证试验结果的条带特征 (1)WB阴性结果：35份WB阴性样本中包括12份Chemclin 600阴性而Abbott i2000呈阳性反应的样本，15份Abbott i2000阴性而Chemclin 600呈阳性反应的样本。其他样本Abbott i2000和Chemclin 600均为阴性。其中Abbott i2000的抗TP抗体最高S/CO比值为3.260，Chemclin 600的抗TP抗体最高S/CO比值为4.080。(2)WB阳性结果：WB阳性128份，WB阳性时4个抗原区分布情况见图1。以TpN45、TpN17、TpN15最高，其中TpN45在128份样本中全部呈阳性。(3)WB不确定结果：WB不确定45份，WB不确定样本4个抗原区分布情况见图2。阳性条带主要在TpN15和TpN17，而TpN47则均为阴性。

二、以WB检测结果为金标准绘制CLIA系统ROC曲线

以WB检测结果为金标准(WB结果为“不确定”的样本未列入)，用SPSS 19.0软件对CLIA系统筛查抗TP抗体的S/CO比值绘制ROC曲线，见图3。当敏感性和特异性最佳时，确定Abbott i2000和Chemclin 600的S/CO比值分别为1.810和4.125。

三、 CLIA系统筛查抗TP抗体不同S/CO比值区间的阳性预测值

当Abbott i2000和Chemclin 600筛查抗TP抗体的S/CO比值分别≥3.0和≥4.0时，筛查试验的阳性预测值≥95%。见表3。

图1　128份WB阳性样本4个抗原区分布情况

图2　45份WB不确定样本4个抗原区分布情况

图3　Abbott i2000和Chemclin 600

抗TP抗体的S/CO比值Chemclin600WB-+不确定阳性预测值(%)Abbotti2000WB-+不确定阳性预测值(%)0~0.9981311.193325.01~1.991762626.12293129.02~2.9946760.0325789.33~3.99512070.6124296.04~4.99120495.20151100.05~5.990122100.00120100.06~9.99062100.00151100.010~19.99060100.0070100.020~29.990240100.00180100.030~39.990241100.0000-≥400110100.0000-

讨论

免疫学检验方法检测病原体特异性抗体，由于方法学本身的问题和患者血清中的某些组分的干扰，都存在相当比例的假阳性，且这一假阳性现象与试剂本身的性能质量并无直接关联。国内外初筛实验室已规范执行抗人类获得性免疫缺陷病毒的结果报告程序；国外对ELISA或CLIA检测抗丙型肝炎病毒抗体结果报告亦已形成一套规范化的程序；但国内鲜有学者借鉴国外规范化的程序来制定抗TP抗体的初筛结果报告规范。本研究通过对208份用全自动CLIA系统(Abbott i2000及Chemclin 600)检测的抗TP抗体筛选试验阳性样本进行WB确认，来初步探讨用这2个系统检测抗TP抗体阳性预测值达95%时的临界值，从而建立起适合本实验室的抗TP抗体初筛检测及结果报告规则供临床借鉴，也可藉此引起相关实验室工作人员和管理层的重视。

本研究结果显示，Abbott i2000与WB的符合率为82.2%，Chemclin 600与WB的符合率为82.8%，与国内学者报道结果相似[4-5]，符合率略低，这可能与样本选取有关。样本来源于复旦大学附属肿瘤医院术前检查时发现的抗TP抗体S/CO比值≥1.0的血清样本，后被收集入组，应属于TP感染的低危人群；其次肿瘤患者梅毒假阳性偏高。出现假阳性的原因可能与某些疾病对抗TP抗体产生干扰有关，如结肠癌、淋巴肉瘤、肝硬化、妊娠、自身免疫性疾病和其他基础疾病等，这些疾病患者体内可能含有抗类脂抗体或抗TP抗体的交叉抗原[6]。另外，年龄也是假阳性产生的一个重要因素，本研究CLIA检测的假阳性样本中部分患者年龄>50岁，这与老年人抗TP抗体测定的假阳性率偏高的报道相符[7-8]，可能是因为老年人免疫功能衰退，容易产生一些针对联接用的白蛋白抗体或是一些异常蛋白质干扰反应[9]。

尽管WB检测结果不受反复冻融、胆红素、血红蛋白等因素的影响，其特异性也较高，但本研究还是出现了一定例数的WB不确定结果，Abbott i2000和Chemclin 600检测的208例样本中各45例。WB结果不确定，即无法判断抗TP抗体的结果，这种情况不排除低危人群中初筛检测结果假阳性，同时还考虑与患者体内抗体处在血清学转换中或TP感染患者正在进行治疗有关。对于此类患者应给予定期随访，即在3个月、半年、1年测其抗TP抗体，如S/CO比值保持在低值范围，且无升高，则抗TP抗体假阳性可能性很大。此外，可以同时检测TP DNA，以便得出确定的阳性和阴性结果，为临床积累更多的经验和提供确诊TP感染的依据。本研究还对WB阳性条带频度分布作了统计， TpN45、TpN17、TpN15为最高，这与文献[6，10]报道不尽一致。这可能与例数有限、样本来源的局限、地域差异、TP基因型的不一致等有一定的关系。提示抗TP抗体筛查试剂抗原量应注意各区的比例，比例不合适、过量均会造成假阳性。WB不确定的单一条带阳性主要是在TpN15和TpN17区，TpN47甚至没有，但是否减低筛查试剂中TpN47的量需进一步探讨。

CLIA检测抗TP抗体以样本的S/CO比值≥1.0作为阳性的依据，可检测出血清抗体处于转换中，抗TP抗体S/CO比值≥1.0处于低值的弱阳性样本[11]，确保献血员的血液安全以及一些创伤性检测的安全。但在TP感染的低流行人群中，甚至99%的特异性也不能提供理想的阳性预测值。因此，不能单独依靠初筛试验阳性结果来判断一个人是否感染TP，需应用具有更高特异性的补充确证试验进行确认分析。而ROC曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标[12]，本研究以WB检测为金标准绘制Abbott i2000和Chemclin 600的ROC曲线，兼顾敏感性和特异性最佳时，Abbott i2000和Chemclin 600检测抗TP抗体的S/CO比值分别为1.810和4.125。此外，从表3结果可见，当Abbott i2000检测抗TP抗体的S/CO比值≥3.0时，阳性预测值≥95.2%；Chemclin 600检测抗TP抗体的S/CO比值≥4.0时，阳性预测值≥96.0%。基于以上数据，临床上应用初筛呈阳性反应样本的S/CO比值来确定是否需要进行确证试验，可以减少需要进行确证试验的工作量，同时也可提高报告检测结果的可靠性，减少初筛检测假阳性人群不必要的就医和精神压力[13]。

在本研究的基础上，拟定一个CLIA检测抗TP抗体结果报告的程序，供临床借鉴：2个检测系统检测当抗TP抗体结果S/CO比值<1.0时，直接报抗TP抗体阴性；当Abbott i2000检测抗TP抗体的S/CO比值≥3.0、Chemclin 600检测抗TP抗体的S/CO比值≥4.0时，无须进行WB确认即可直接报告抗TP抗体阳性；当Abbott i2000检测抗TP抗体的S/CO比值在1.0～3.0、Chemclin 600检测抗TP抗体的S/CO比值在1.0～4.0时，有条件的实验室建议进行WB确认或TP核酸检测，以减少误诊率。建议每个用ELISA或CLIA检测抗TP抗体的实验室在选用某一检测试剂(或检测系统)前，都应做与本研究类似的探讨。

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(本文编辑：姜敏)

(1.同济大学医学院病原生物学教研室，上海200092；

2.复旦大学附属肿瘤医院检验科复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032)

摘要：目的探讨化学发光免疫分析法(CLIA)检测抗梅毒螺旋体(TP)抗体筛查试验信号/临界值(S/CO)比值与确证试验阳性的相关性。方法经Abbott i2000 CLIA系统(简称Abbott i2000)或科美东雅Chemclin 600 CLIA系统(简称Chemclin 600)检测抗TP抗体S/CO比值≥1.0的血清样本208份，用免疫印迹法(WB)对抗TP抗体筛查试验结果进行确认评价。采用SPSS 19.0软件绘制抗TP抗体S/CO比值受试者工作特性(ROC)曲线，得到敏感性和特异性最佳时的S/CO比值；计算各个S/CO比值区间的阳性预测值，得到阳性预测值≥95%的S/CO比值。结果Abbott i2000或Chemclin 600检测抗TP抗体S/CO比值≥1.0的血清样本208份，WB检测阳性128份，阴性35份，不确定45份，2个CLIA系统与WB的符合率分别为82.2%和82.8%。当Abbott i2000和Chemclin 600抗TP抗体筛查的S/CO比值分别为≥3.0和≥4.0时，阳性预测值≥95%。结论Abbott i2000和Chemclin 600检测抗TP抗体的S/CO比值分别为1.0～3.0和1.0～4.0的样本应进行WB确证试验，S/CO比值大于上述上限的样本可直接报告抗TP抗体阳性，这样既能减少确证试验的样本数，又可提高检测报告的可靠性。

关键词：抗梅毒螺旋体抗体；化学发光免疫分析法；免疫印迹法

Study on the correlation between anti-TP antibody S/CO ratio by chemiluminescence immunoassay and positive results by confirmation assayXUXiaofeng1，JIANGMinglei2，LURenquan3，ZOUChunyuan2,GONGZhiyun2,SHENLi1,GUOLin2.(1.InstituteforInfectiousDiseasesandVaccineDevelopment,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiCancerCenter,FudanUniversity/DepartmentofOncology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the correlation between anti-treponema pallidum(TP)antibody signal-to-cut off(S/CO)ratio by chemiluminescence immunoassay (CLIA) and positive results by confirmation assay. MethodsA total of 208 anti-TP antibody positive samples (S/CO ratio≥1.0) were screened out by 2 CLIA systems, Abbott i2000 CLIA system (Abbott i2000)and Kemei Dongya Chemclin 600 CLIA system (Chemclin 600). The results were confirmed by western blotting (WB). Receiver operating characteristic(ROC)curve at optimal sensitivity and specificity was analyzed, and optimal S/CO threshold value was obtained by SPSS 19.0 software. The positive predictive value was calculated with every S/CO ratio interval， and the S/CO ratio of positive predictive value≥95%was obtained. ResultsBy Abbott i2000 or Chemclin 600, 208 samples′ S/CO ratio was determined.By WB, 35 cases of them were confirmed as negative, 128 cases were confirmed as positive, and 45 cases were indeterminate.The coincidence rates of WB compared with the 2 CLIA systems were 82.2% and 82.8%, respectively．When anti-TP antibody S/CO ratio of Abbott i2000 was ≥3.0, and anti-TP antibody S/CO ratio of Chemclin 600 was ≥4.0, the positive predictive value was ≥95%. ConclusionsIt is proposed that WB should be used if the S/CO ratio ranges are 1.0-3.0 determined by Abbott i2000 and 1.0-4.0 determined by Chemclin 600. If the S/CO ratio is above the upper limit, the samples can be reported as positive directly. It can not only reduce the confirmation assay sample number but also improve the reliability of determination report.

Key words:Anti-treponema pallidum antibody; Chemiluminescence immunoassay; Western blotting

收稿日期：(2015-02-17)

通讯作者：沈利，联系电话：021-65985615。

作者简介：许晓峰，男，1976年生，学士，主管技师，主要从事病原体免疫学研究。

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)12-1185-05R446.61

文献标志码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.005