苗秋实,鲍秀琦,姜　威,李　璇,韩宇鹏

(1.佳木斯大学研究生学院,黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)



骨髓单核细胞移植对溃疡性结肠炎炎性因子IL-1和MFG-E8变化的研究①

苗秋实1,鲍秀琦2,姜威2,李璇1,韩宇鹏1

(1.佳木斯大学研究生学院,黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探讨骨髓单核干细胞移植对溃疡性结肠炎的治疗作用。方法：建立溃疡性结肠炎的动物实验，采用骨髓单核干细胞移植技术，移植后在不同的时间段取结肠组织，检测IL-1和MFG-E8的变化。 结果：移植后7d，移植组的IL-1表达水平与PBS组、对照组相比，明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；移植后14d，移植组的IL-1表达水平与PBS组、对照组相比，明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，与移植后7d的IL-1表达水平相比，差异也有统计学意义(P<0.05)；移植后7d，移植组的MFG-E8表达水平与PBS组、对照组相比，明显降低，差异有统计学意义(P<0.05);移植后14d，移植组的MFG-E8表达水平与PBS组、对照组相比，明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，与移植后7d的MFG-E8表达水平相比，差异也有统计学意义(P<0.05)。结论：骨髓单核细胞移植可降低溃疡性结肠炎炎性因子的水平，对大鼠体内的炎性环境带来一定的缓解作用。

关键词:骨髓单核细胞移植；溃疡性结肠炎；炎性因子；异常表达

目前研究显示UC患者存在自身免疫功能失衡，自身免疫是炎性病变，由自身免疫介导[1]，大量炎性介质和细胞因子聚集于肠黏膜引起肠黏膜的炎性反应[2]，近年来随着干细胞移植研究的不断深入，溃疡性结肠炎的治疗看到了更大的前景[3]。利用干细胞移植治疗UC，目前已经在国内外实验中成为热点，已有研究证实MSCs经尾静脉移植入大鼠UC模型体内后，可通过血液循环迁移至受损肠道。本研究建立溃疡性结肠炎的动物实验，采用骨髓单核干细胞移植技术，移植后在不同的时间段取结肠组织，检测IL-1和MFG-E8的变化，旨在探讨骨髓单核干细胞移植对溃疡性结肠炎的治疗作用。

1　材料和方法

1.1材料

健康成年SD大鼠，雄性，体重250g；弗氏完全佐剂(Sigma,美国)；PBS缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司)；双缩脲法蛋白定量试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)。

1.2方法

选择45只健康清洁级SD大鼠45只，均为6～8周龄，将这些大鼠随机分为3组，每组15只，分别为移植组、PBS组和正常对照组。要对移植组、PBS组大鼠进行模型制备，利用免疫复合法来进行UC模型的制造。

分离出家兔结肠的黏膜层，低温离心，取上清液，并使用双缩脲法检测其蛋白含量(20mg/mL)，加入等量弗氏完全佐剂制成1:1抗原乳化液。间隔14d，将0.4mL抗原乳化剂在2次在大鼠腹股沟、足跖处注射，灌肠后大鼠保持平躺至自然清醒[3]。造模24h后，在移植组大鼠的尾静脉处注入细胞悬液，然后对大鼠的精神、进食和活动情况进行观察，并在细胞移植后的3d、7d、14d，分别取3组大鼠中的5只进行处死，对结肠部分进行剖取，并剪开纵行，对其进行PBS冲洗，然后对结肠的形态，黏膜损伤进行观察。对结肠组织进行常规石蜡包埋，进行连续切片和HE染色，在光学显微镜下观察组织形态学变化。提取肠黏膜固有层单个核细胞，Western blotting检测检测肠黏膜细胞因子水平，用洗片机洗片，图像分析软件测其灰度值，与内参的灰度值比较为其蛋白的相对含量。

1.3统计学方法

2　结果

2.1三组不同阶段的IL-1表达水平比较

移植后7d，移植组的IL-1表达水平与PBS组、对照组相比，明显降低，差异有统计学意义(P<0.05);移植后14d，移植组的IL-1表达水平与PBS组、对照组相比，明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，与移植后7d的IL-1表达水平相比，差异也有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　三组不同阶段IL-1含量比较

注：与PBS组相比，△P<0.05。与对照组相比，﹡P<0.05。与移植后7d相比，●P<0.05。

2.2移植术前后MFG-E8表达水平比较

移植后7d，移植组的MFG-E8表达水平与PBS组、对照组相比，明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；移植后14d，移植组的MFG-E8表达水平与PBS组、对照组相比，明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，与移植后7d的MFG-E8表达水平相比，差异也有统计学意义(P<0.05)；见表2。

表2　三组不同阶段MFG-E8含量比较

注：与PBS组相比，△P<0.05。与对照组相比，﹡P<0.05。与移植后7d相比，●P<0.05。

3　讨论

骨髓间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)、集落刺激因子(Clone Stimulating factor,CSF)、干细胞因子(Stem Cell Factor，SCF)、间质细胞源性因子1(Stromal Cell．Derived Factor-I，SDF-1)、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor，IGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、碱性纤维母细胞因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等[5]，其中部组织发生炎性反应时，VEGF表达增加，局部注射SDF-1将进一步上调损伤组织内源性VEGF的表达，SDF-1与蛋白多糖结合后对造血前体细胞移动的诱导作用增强，且这种作用具有高度的特异性。上述因子已被证实有促进血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖，发挥促炎性的作用[6]。干细胞移植后，移植区内这些细胞因子的含量明显增加，他们通过自分泌或旁分泌的方式，在改善宿主的炎性反应方面起着十分重要的作用。过往研究揭示，MSC的这几种作用途径在治疗中可能同时存在，当宿主发生炎性反应时[7~9]，细胞内可能分泌产生大量有利于细胞再生的物质和信号，刺激植入的干细胞分化为炎症免疫细胞，改善炎性反应。环境中的调节信号系统通过与基因簇的相互作用，决定了特定基因的表达，并提供定向分化所需的电、机械刺激及所需的因子。本研究通过建立溃疡性结肠炎的动物实验，采用骨髓单核干细胞移植技术，移植后在不同的时间段取结肠组织，检测IL-1和MFG-E8的变化。结果发现移植后3d，移植组的MFG-E8表达水平与PBS组、对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)； 移植后7d、移植后14d，移植组的MFG-E8表达水平与PBS组、对照组相比，明显降低，差异有统计学意义。本研究的结果提示骨髓单核细胞移植可降低溃疡性结肠炎炎性因子的水平，对大鼠体内的炎性环境带来一定的缓解作用。

参考文献:

[1]颜玉，韩桂华，陈刚.自身免疫性胰腺炎1例[J].黑龙江医药科学，2013,36(05):109-110

[2]姜威,颜玉,郑强,等.溃疡性结肠炎Toll样受体表达和NF-kB变化及益生菌的作用研究[J].黑龙江医药科学，2013,36(05):34-35

[3]BaumgartDC,Carding SR.Inflammatory bowel disease:cause and immunobiology[J]. Lancet，2012,369(9573):1627-l640

[4]Collins P,Rhodes J.Ulcerative colitis:diagnosis and management[J].BMJ，2006, 3(7563): 340-343

[5]谷涌泉,张建,齐立行,等.骨髓动员刺激后自体骨髓源单个核细胞移植治疗下肢缺血的初步临床研究[J].中国修复重建外科杂志，2006,20(10):1017-1020

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[7]Saleh A Naser，Melissa Arce，Anam Khaja，et al.Role of ATG16L,NOD2 and IL23R in Crohn's disease pathogenesis[J].World Journal of Gastroenterology,2012,5(2):23-24

[8]张榕,施茵,关鑫.GH-SOCS2-IGF-1轴对溃疡性结肠炎肠黏膜屏障的影响[J].世界华人消化杂志,2010,23(8):112-113

The effects of bone marrow mononuclear cell transplantation

on ulcerativecolitis inflammatory cytokines (IL - 1 and MFG - E8)

MIAOQiu-shi1，BAOXiu-qi2，JIANGWei2，LIXuan1，HANYu-peng1

(1. Department of Clinical Medicine Major, Jiamusi University Graduate School, Jiamusi 154007; 2. Department of Digestion, the First Hospital Affiliated to Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Abstract：Objective:To investigate bone marrow mononuclaer stem cell transplantation for the treatment of ulcerative colitis. Methods:The ulcerative colitis animal experiments were established by using bone marrow mononuclear stem cell transplant technology,in different time periods after transplantation in colon tissue,detection MFG-E8 and IL-1 change. Results:7d after transplantation, the expression level of IL - 1 in transplantation group compared with the PBS group and the control group, a significant decrease, the difference was statistically significant(P<0.05);14 d after transplantation, the expression level of IL -1 in transplantation group compared with the PBS group and the control group, a significant decrease, the difference was statistically significant(P<0.05),and the expression level of IL - 1 in 7d after transp lantation, compared differences have statistical significance(P<0.05);7d after transplantation, the expression level of MFG - E8 in transplantation group compared with the PBS group and the control group, a significant decrease, the difference was statistically significant(P<0.05);14d after transplantation, the expression level of MFG - E8 in transplantation group compared with the PBS group and the control group, a significant decrease, the difference was statistically significant(P<0.05),and the expression level of MFG - E8 in 7 d after transplantation, compared differences have statistical significance,P<0.05).Conclusion:bone marrow mononuclear cell transplantation can reduce the levels of inflammatory cytokines ulcerative colitis, the rat inflammatory environment bring some relief.

Key words:bone marrow mononuclear cell transplantation；ulcerative colitis；inflammatory factors；abnormal expression

中图分类号：R574.62

文献标识码：B

文章编号：1008-0104(2015)06-0043-03

基金项目：①佳木斯大学研究生科科技创新项目,编号：LM2014-016。

作者简介：苗秋实(1986~)女，天津人，在读硕士研究生。

通讯作者：鲍秀琦(1963~)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail：674399943@qq.com。

(收稿日期：2015-05-07)