金纬纬 蔡平生 方轶萍 姚锐

多囊卵巢综合征患者子宫内膜HIF-1α表达及与子宫内膜容受性的关系

金纬纬 蔡平生 方轶萍 姚锐

目的观察子宫内膜容受性相关因子α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）在多囊卵巢综合征（PCOS）妇女子宫内膜组织表达情况。方法PCOS引起的不孕不育患者40例为PCOS组，同期因男性因素或输卵管因素就诊的不孕症患者40例为对照组，分别采用实时荧光定量PCR、蛋白印迹法（Western blot）检测HIF-1α、VEGF基因和蛋白的相对表达量。结果与对照组比较，PCOS患者子宫内膜组织HIF-1α、VEGFmRNA相对表达水平降低（0.45±0.041比1、0.65±0.053比1，P＜0.01）；PCOS组VEGF和HIF-1α蛋白表达也较对照组降低（0.085±0.053比0.25±0.015、0.036±0.021比0.096±0.032，P＜0.01）。结论PCOS患者子宫内膜HIF-1α、VEGF表达降低。

多囊卵巢综合征；子宫内膜容受性；HIF-1α；VEGF

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是由神经及激素调节紊乱引起的，以高雄激素血症及慢性不排卵为特征的疾病。据统计有4%～12%生育年龄女性患有PCOS，是目前无排卵型不孕症的最主要原因[1]。文献报道，PCOS引起的不孕与子宫内膜容受性密切相关[2]，而子宫内膜血管生成及相关血管生成因子的表达与子宫内膜容受性密切相关[3-4]。

低氧诱导因子家族（hypoxia-inducible factors，HIFs）是低氧诱导细胞产生的特异性蛋白家族，hypoxia-inducible factor-1（HIF-1）即I类低氧诱导因子是HIFs成员，是细胞应对低氧环境特异性表达的基因。低氧诱导因子HIF-1α是调控子宫内膜血管生成的重要调控因子。因此，检测PCOS患者子宫内膜HIF-1α表达情况可反应子宫内膜血管生成，可作为检测子宫内膜容受性重要指标。本研究观察PCOS患者子宫内膜HIF-1α、VEGF表达情况，探讨PCOS患者子宫内膜容受性改变引起的不孕之间的关系。

1 资料及方法

1.1 临床资料选取2012年1月—2013年2月本院妇科门诊就诊多囊卵巢综合征患者40例，符合2003年欧洲人类生殖和胚胎与美国生殖医学会鹿特丹专家会议推荐标准：（1）稀发或无排卵；（2）高雄激素血症或具有高雄激素的临床表现；（3）B超显示为多囊卵巢者（单侧或双侧卵巢有＞12个直径2～9mm的卵泡）；（4）凡具备以上3条中任意2条者，可诊断为多囊卵巢综合征，并排除其他高雄激素血症。40例患者均为已婚女性，年龄25～37岁，平均（31.5± 5.8）岁，不孕史3～7年，平均4.5年。同期因男性因素或输卵管因素就诊的不孕症患者40例为对照组，年龄23～35岁，平均（32.5±5.4）岁。均为月经周期正常；B超监测有单卵泡成熟并排卵；基础内分泌检查结果正常；妇科检查及阴道B超未提示妇科器质性病变存在；近3个月未用过激素类药物。两组患者年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 主要试剂Trizol Reagent、QuantiTect SYBR Green PCR Kit购自Invitrogen公司；cDNA合成试剂盒购自Takara公司；anti-HIF-1α单克隆抗体购自美国CST公司；anti-VEGF单克隆抗体购自美国CST公司；羊抗兔二抗购于武汉博士德生物公司；RIPA裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 组织标本的提取PCOS组：40例PCOS患者均应用促排卵治疗，月经第12天开始阴道B超隔天监测卵泡发育直至成熟卵泡排出，确定排卵日，促排卵治疗方案包括：克罗米芬（CC）方案：CC 1天50～100mg，月经第5天开始，连续使用5天，月经第12天开始隔天B超监测卵泡，至卵泡直径18～20mm时，应用HCG。对照组：采用自然周期阴道B超监测排卵。经患者知情同意，经B超隔天监测排卵，并确认排卵后，排卵后5～7天经严格消毒以小号刮匙于子宫前壁刮取内膜组织约50mg，新鲜组织以冻存管分装后立即置入液氮罐中，后转入-80℃冰箱保存。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测子宫内膜容受性相关因子（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA采用液氮研磨法将组织磨成粉末，加入Trizol（Invitrogen）混合，按Trizol说明书抽提总RNA。利用在线Primer 3.0软件设计引物，GC含量40%～60%，产物大小89～203bp，再用Oligo 6.0软件评估。引物均跨内含子以减少基因组DNA的干扰，由Invitrogen公司合成。引物序列：HIF-1α：forward primer，TCACCACAGGACAGTACAGGATGC；reverse primer，CCAGCAAAGTTAAAGCATCAGGTTCC。VEGF：forward primer，ACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATG；reverseprimer，TTCTGTATCAGTCTTTCCTGGTGAG。 β-actin（β肌动蛋白）：forward primer，TCATGAAGT GTGACGTTGACATCCGT；reverse primer，CCTAGAAG CATTTGCGGTGCACGATG。反应在25μL的体系中进行，其中2×QuantiTect SYBR Green PCR 12.5μL、10μM的上下游引物各1μL、样本cDNA 2μL（300ng）、RNA酶灭活水8.5μL。热循环如下：94℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、60s，40个循环；72℃、10min。

1.3.3 Western blot组织细胞全蛋白提取用RIPA蛋白裂解液，置于冰上裂解30min，中间需反复振荡蛋白裂解液，然后用BIO-RAD凝胶电泳系统，8% SDS-PAGE胶，电泳，恒压100V，90min；转膜，NC膜，恒压100V，90min。用TBST配置的5%脱脂牛奶室温封闭1h，然后用TBST配置的2%BSA按相应浓度稀释抗体，4℃轻摇孵育抗体过夜。第二天，回收一抗，TBST室温洗膜10min，2次；用TBST配制的2% BSA按照1：5000稀释二抗，NC膜室温孵育二抗1h，然后TBST洗膜10min，2次。曝光过程由LANI2300曝光机完成。

1.4 统计学方法应用SPSS17.0软件分析数据，计量资料以均数±标准差（） 表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 PCOS患者子宫内膜组织VEGF和HIF-1α mRNA的表达目的基因mRNA相对表达量用以下公式计算：folds=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct内参照基因）样品组/（Ct目的基因-Ct内参照基因）对照组[5]，得出VEGF和HIF-1α相对表达量即folds值。结果显示，VEGF和HIF-1α相对表达量平均值分别为0.45±0.041和0.65±0.053，对照组VEGF和HIF-1α相对表达量均为1，统计学分析显示PCOS组VEGF和HIF-1α mRNA相对表达量明显低于对照组内膜组织，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1（封二）。

2.2 PCOS组患者子宫内膜组织VEGF和HIF-1α蛋白的表达以β-actin作为内参蛋白，PCOS组VEGF和HIF-1α蛋白表达分别为0.085±0.053和0.036±0.021，而对照组为0.25±0.015和0.096± 0.032，PCOS组中VEGF与HIF-1α蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2（封二）。

3 讨论

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是目前无排卵型不孕症的最主要原因。既往研究[6]多关注的是PCOS与肥胖、糖尿病、胰岛素耐受等代谢性疾病的关系。近年子宫内膜容受性的研究已成为PCOS不孕症的研究热点问题。子宫内膜容受性是指子宫内膜对于胚胎的接受程度，至今已发现多种因素与其相关，如细胞间黏附因子（整合素、选择素等）[7]、孕激素[8]、性激素及细胞生长因子（白介素、转化生长因子等）[9-12]。而子宫内膜血管生成及相关血管生成因子的表达与子宫内膜容受性密切相关[3-4]。在子宫内膜血管生成信号通路中，低氧诱导因子对血管生成及血管生成相关基因表达具有显著的调控作用[4]。

VEGF是一类血管生成因子，具有诱导血管内皮细胞增殖分裂，促使新生血管形成的作用。既往研究表明[13]在子宫内膜癌及子宫内膜异位症患者子宫内膜组织中VEGF特异性高表达，VEGF特异性高表达可显著增加子宫内膜血供，提供肿瘤及子宫内膜异常增生所需的大量营养物质，而在PCOS患者子宫内膜组织中，VEGF出现特异性低表达，且VEGF特异性低表达与PCOS患者子宫内膜容受性及PCOS患者不孕密切相关[14]。本研究发现，PCOS患者子宫内膜组织中VEGF呈现特异性低表达，与既往研究符合。

低氧诱导因子家族（hypoxia-inducible factors，HIFs）是低氧诱导细胞产生的特异性蛋白家族，编码一类转录激活因子，参与细胞应对低氧多种生理生化过程，调控特异性基因的表达过程。研究显示，HIF-1α在人体组织新生血管形成过程中发挥重要作用。HIF-1α是调控子宫内膜血管生成的重要调控因子，可直接调控VEGF的表达。既往报道指出[15]，在肝癌细胞中，由于肿瘤细胞特殊代谢通路及肿瘤细胞特殊微环境，诱导激活HIF-1α的表达并进入细胞核内，HIF-1α与PCG家族蛋白Cbx4结合（一类E3泛素连接酶）形成转录复合体，从而启动VEGF的转录，诱导VEGF表达，加速肝癌组织血管生成过程，刺激肝癌细胞分裂增殖；而在骨肉瘤细胞中[16]，利用HIF-1α特异性siRNA敲除HIF-1α基因，VEGF在mRNA水平显著下调。本研究检测的HIF-1α在低氧环境中特异性高表达，在正常氧压环境中，HIF-1α羟基化，但是在低氧条件下，由于HIF-1α羟基化介导的降解通路被阻断，HIF-1α基因在细胞核内累积，细胞产生一系列HIF-1α依赖的应对低氧的生理生化反应。在血管生成信号通路中，HIF可通过激活PI3K/AKT、MEK等通路调控血管生成细胞的增殖、迁移，调节血管内渗透压及血管生成趋向性[17]。

综上所述，PCOS不孕不育患者子宫内膜HIF-1α和VEGF表达都出现显著下调，结合既往研究，我们目前考虑PCOS不孕不育患者子宫内膜中HIF-1α可调控VEGF的表达，HIF-1α和VEGF表达下调导致患者子宫内膜血管生成受阻，从而影响内膜容受性及胚胎着床过程，造成PCOS患者不孕不育。但是PCOS不孕不育患者子宫内膜HIF-1α调控VEGF的具体过程，还需后续试验验证。

［1］Michael T Sheehan.Polycystic ovarian syndrome：diagnosis and management［J］.Clin Med Res，2004，2（1）：13-27.

［2］Lopes IM，Baracat MC，Simoes Mde J，et al.Endometrium in women with polycystic ovary syndrome during the window of implantation［J］.Rev Assoc Med Bras，2011，57（6）：702-709.

［3］Peitsidis P，Agrawal R.Role of vascular endothelial growth factor in women with PCO and PCOS：a systematic review［J］.Reprod Biomed Online，2010，20（4）：444-452.

［4］Hirota K，Semenza GL.Regulation of angiogenesis by hypoxia-inducible factor 1［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2006，59（1）：15-26.

［5］Abdelmohsen K，Hutchison ER，Lee EK，et al.MiR-375 inhibits differentiation of neurites by lowering HuD Levels［J］. Molecular and cellular biology，2010，30（17）：4197-4210.

［6］Cussons AJ，Stuckey BG，Walsh JP，et al.Polycystic ovarian syndrome：marked differences between endocrinologists and gynaecologists in diagnosis and management［J］.Clin Endocrinol（Oxf），2005，62（3）：89-95.

［7］Giudice LC.Endometrium in PCOS：Implantation and predisposition to endocrine CA［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2006，20（2）：235-244.

［8］Usadi RS，Legro RS.Reproductive impact of polycystic ovary syndrome［J］.Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2012，19（6）：505-511.

［9］Kolbus A，Walch K，Nagele F，et al.Interleukin-1 alpha but not interleukin-1 beta gene polymorphism is associated with polycystic ovary syndrome［J］.J Reprod Immunol，2007，73（2）：188-193.

［10］Raja-Khan N，Urbanek M，Rodgers RJ，et al.The role of TGF-beta in polycystic ovary syndrome［J］.Reprod Sci，2014，21（1）：20-31.

［11］Barreca A，Del Monte P，Ponzani P，et al.Intrafollicular insulin-like growth factor-II levels in normally ovulating women and in patients with polycys－tic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，1996，65（4）：739-745.

［12］Sahin SB，Ayaz T，Cure MC，et al.Fibroblast growth factor 21 and its relation to metabolic parameters in women with polycystic ovary syndrome［J］.Scand J Clin Lab Invest，2014，74（6）：465-469.

［13］Dobrzycka B，Terlikowski SJ，Kwiatkowski M，et al.Prognostic significance of VEGF and its receptors in endometrioid endometrial cancer［J］.Ginekol Pol，2010，81（6）：422-425.

［14］唐智华，杨雪峰.多囊卵巢综合征患者着床窗口期子宫内膜VEGF、MIF的表达及意义［J］.中国妇幼保健，2011， 26（5）：737-739.

［15］Li J，Xu Y，Long XD，et al.Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity［J］.Cancer Cell，2014，25（1）：118-131.

［16］Wu Q，Yang SH，Wang RY，et al.Effect of silencing HIF-1alpha by RNA interference on expression of vascular endothelial growth factor in osteosarcoma cell line SaOS-2 under hypoxia［J］.Ai Zheng，2005，24（5）：531-535.

［17］Karar J，Maity A.PI3K/AKT/mTOR Pathway in Angiogenesis［J］.Front Mol Neurosci，2011，4（51）：1-8.

（收稿：2015-10-17修回：2016-03-11）

Expression of HIF-1in Polycystic Ovary Syndrome Patients and Its Relationship with Endometrial Receptivity

JIN Weiwei,CAI Pingsheng,FANG Yiping,YAO Rui.Department of Obstetrics and Gynecology,WenzhouHospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Wenzhou(325000),China

ObjectiveTo determine the level of of hypoxia-inducible factor-1（HIF-1）and vascular endothelial growth factor（VEGF）in endometrium from polycystic ovary syndrome（PCOS）patients.MethodsForty women with PCOS-induced sterility and another 40 women with infertility due to male factor or fallopian tube factor were enrolled in this study.The relative expressions of HIF-1 and VEGF mRNA and protein in endometrial tissues from two groups were detected by real-time quantitative PCR and Western blot,respectively.ResultsThe expressions of HIF-1 and VEGF mRNA in PCOS patients were significantly higher than that in the other group（HIF-1：0.45± 0.041 vs 1;VEGF：0.65±0.053 vs 1;all P＜0.01）;the expressions of proteins were in the same pattern（HIF-1：0.085±0.053 vs 0.25±0.015;VEGF：0.036±0.021 vs 0.096±0.032;all P＜0.01）.ConclusionThe expressions of HIF-1and VEGF in PCOS women are declined.

polycystic ovary syndrome;endometrial receptivity;HIF-1;VEGF

浙江省温州市中西医结合医院妇产科（温州325000）

蔡平生，Tel：13757890261；E-mail：462080386@qq.com