南子晴 华春珍 王晓芳 庞福珍

●临床研究

肺炎支原体肺炎患儿急性期和恢复期血浆H-ficolin和L-ficolin水平分析

南子晴 华春珍 王晓芳 庞福珍

目的 了解肺炎支原体肺炎患儿急性期和恢复期血浆中H-ficolin、L-ficolin水平的变化。方法 采用ELISA法检测85例肺炎支原体肺炎患儿急性期和恢复期血浆H-ficolin、L-ficolin水平，并进行相关性分析。结果 急性期H-ficolin水平1.8～25.2μg/ml，平均（11.9±5.9）μg/ml，恢复期H-ficolin水平0.3～26.5μg/ml，平均（10.1±5.7）μg/ml，急性期明显高于恢复期（Z=2.161，P=0.031）。急性期L-ficolin水平0.2～10.6μg/ml，平均（4.5±2.3）μg/ml，恢复期L-ficolin水平0.03～10.2μg/ml，平均（4.6±2.2）μg/ml，急性期和恢复期无统计学差异（t=0.245，P=0.807）。患儿急性期血浆H-ficolin水平与L-ficolin水平明显相关（r=0.22，P=0.039）。结论 H-ficolin可能参与儿童肺炎支原体肺炎疾病过程。

肺炎支原体 肺炎 儿童 H-ficolin L-ficolin

肺炎支原体（mycoplasma pneumonia，MP）是引起儿童呼吸道感染的常见病原。近年来，肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）逐渐成为儿童社区获得性肺炎的重要类型之一，MPP患儿除可有反复咳嗽、发热等症状外，也可伴发心肌炎、脑膜炎、肾炎等多系统的肺外并发症[1]。研究表明，MPP能引起机体细胞免疫和体液免疫功能紊乱，激活补体系统造成肺内外免疫损伤和炎性损伤[2]。补体系统在体内参与机体抗微生物防御反应，亦介导免疫病理的损伤性反应[3]。已发现糖类模式识别分子Ficolin（包括H-ficolin和L-ficolin）能识别病原体表面的病原相关模式分子并与之结合，激活MBL相关丝氨酸蛋白酶，从而启动凝集素途径激活补体系统，因此推测MPP患儿血浆中H-ficolin和L-ficolin可能存在含量的变化。本研究观测了杭州师范大学附属医院儿科住院的85例MPP患儿血浆中H-ficolin和L-ficolin在急性期和恢复期水平的变化，探究其在MPP发病中的可能机制，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2012年7月至2013年6月杭州师范大学附属医院儿科收治的MPP患儿85例，其中男50例（58.8%），女35例（41.2%），男女比例1.43∶1。年龄11个月～14岁，平均（6.3±3.2）岁，其中0～1岁1例（1.2%），＞1～3岁17例（20.0%），＞3～6岁28例（32.9%），＞6～14岁39例（45.9%）；4岁以上学龄前期和学龄期儿童共67例（78.8%）。所有患儿均有咳嗽症状，78例反复发热，其中高热62例，中等度发热13例，低热3例，热程1～21（6.7±3.1）d。所有患儿X线胸片均有斑片状或大片状密度增高影。

1.2 入选标准 （1）符合中华人民共和国卫生部2012年9月3日发布的卫生行业标准WS382-2012肺炎的诊断；（2）恢复期MP IgG滴度较急性期上升4倍以上；（3）痰液或咽拭子MP-DNA阳性。本研究的恢复期界定为体温正常，咳嗽症状明显减轻2d后，或X线胸片提示阴影明显吸收。

1.3 试剂和仪器 人H-ficolin ELISA试剂盒（生产批号：12504K0113-K）和L-ficolin ELISA试剂盒（生产批号：11096K1112-G）为荷兰Hycult Biotech生物技术公司产品。测定仪器为Molecular device公司的酶标仪。EDTA抗凝管为浙江康是医疗器械有限公司产品。

1.4 方法 所有研究对象于入院时及经治疗后恢复期采集静脉血1.5ml，室温静置1h后，2 000×g室温离心15min，分离血浆，分装2管，每管200μl，置-70℃冰箱保存待用。检测时，标本室温复温并经漩涡振荡混匀标本。血浆H-ficolin和L-ficolin检测采用ELISA法以复孔完成，检测H-ficolin时样本以1∶40稀释，检测L-ficolin时标本以1∶20稀释。具体操作如下：按照要求稀释标准品和样本，每孔加入100μl，室温（L-ficolin试剂盒37℃）孵育1h；洗涤4次后每孔加入示踪剂100μl，室温孵育1h；洗涤4次后每孔加入100μl链酶亲和素过氧化物酶，室温孵育1h，洗涤后每孔加入100μ TMB底物显色，室温孵育30min，再在每孔加入100μl终止液中止反应并经酶标仪在450nm波长处读数，根据标准曲线自动得出待测样品中H-ficolin和L-ficolin含量。MPP患儿急性期与恢复期抽血时间间隔2～11d，平均（5.5±1.7）d。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，正态分布计量资料采用表示，组间比较采用独立样本t检验，非正态分布计量资料以中位数表示，组间比较采用非参数检验（Mann-Whitney检验）；相关性分析采用Pearson相关分析法。

2 结果

2.1 临床治疗和结果 所有患儿均治愈出院，住院时间为 4～17（9.3±2.2）d。其中阿奇霉素治愈 80例（94.1%），红霉素治愈2例（2.4%），阿奇霉素治疗效果欠佳，后改红霉素治疗治愈3例（3.5%）。曾采用甲基强的松龙静脉滴注16例（18.8%），所有患儿均未采用丙种球蛋白注射。

2.2 MPP患儿急性期和恢复期血浆H-ficolin、L-ficolin水平比较 研究总体急性期血浆H-ficolin水平明显高于恢复期（Z=2.161，P=0.031）；急性期和恢复期男性和女性患儿血浆H-ficolin水平均无统计学差异（Z= 0.335、0.746，均P＞0.05）；研究总体急性期和恢复期血浆L-ficolin水平无统计学差异（t=0.245，P＞0.05）；急性期和恢复期男、女患儿血浆L-ficolin水平均无统计学差异（t=1.081、0.090，均P＞0.05）。

2.3 相关性分析 患儿急性期和恢复期血浆H-ficolin水平与年龄无明显相关（r=0.158、0.048，P=0.149、0.665）；患儿急性期和恢复期血浆L-ficolin水平与年龄无明显相关（r=0.105、0.066，P=0.342、0.550）。急性期患儿血浆H-ficolin水平与L-ficolin水平明显相关（r=0.22，P=0.039），但恢复期两者之间相关性不明显（r=0.032，P=0.768）。

3 讨论

MPP的发病机制复杂，免疫学机制被认为占有重要的地位。研究表明，MPP患者热程长，病情重，肺部实变严重，伴多系统肺外系统症状的患者IgG、IgM、IgA等体液免疫指标上升明显，提示免疫因素是在MPP发病中起重要作用[4]。本组MPP患儿主要为4岁以上学龄前期和学龄期儿童，即为免疫系统相对完善的儿童，免疫损害也较容易发生。

Ficolin是一组存在于脊椎动物和无脊椎动物体内，组织分布广泛的凝集素蛋白[5]，最早由Ichijo等[6-7]从猪子宫内膜中作为TGF-β结合蛋白分离出来，与甘露聚糖结合凝集素（mannose binding lectin，MBL）具有类似的结构和功能，有胶原蛋白样区和纤维蛋白样区。血浆中的Ficolin可结合病原体表面的糖类配体，通过调理吞噬作用及凝集素途径激活补体，是天然免疫中的效应分子[8]。已发现，人Ficolin有3种：M-ficolin(又称ficolin-1，ficolin/p35相关蛋白)、L-ficolin（又称ficolin-2，p35，Hucolin或EBP-35）和H-ficolin（又称ficolin-3，Hakata antigen）[9]。前者为主要表达于肺和单核细胞膜表面的相关蛋白，血清中含量很低，而后两者是血清蛋白，主要存在于血清中[10]。目前国内罕有关于人血清Ficolin水平的研究，本组MPP患儿急性期和恢复期血浆H-ficolin和L-ficolin水平的定量检测结果，一定程度上反应了儿童中血浆H-ficolin和L-ficolin水平，为今后同类研究提供一定参考。

H-ficolin和L-ficolin均有抗感染功能，其机制主要由两个方面：一是能识别病原体表面的病原相关模式分子并与之结合激活MBL相关的丝氨酸蛋白酶，进而裂解补体产生C3b、C4b等调理素，以促进吞噬细胞内吞作用；二是直接与吞噬细胞表面的Ficolin特异性受体结合，从而拉近了病原体与吞噬细胞之间的距离，利于病原体被吞噬和清除[8]。H-ficolin主要在肝脏和肺中表达，且在肺中表达大于其他组织，其启动凝集素途径能力强于L-ficolin和M-ficolin，并证实H-ficolin具有耐细菌胶原酶的特性[11]。L-ficolin主要在肝脏中表达，与肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等细菌结合活性较强[12]，在体内外能结合糖蛋白、血凝素和神经氨酸酶，能抑制流感病毒[13]。本组为MPP患儿，急性期血浆H-ficolin水平显著高于恢复期，考虑与MPP患儿组织炎性损伤主要限于肺部有关，MP感染肺部可能刺激了H-ficolin的表达从而利于病原体被调理吞噬而清除，至于是否通过与MBL相关丝氨酸蛋白酶激活补体，有待体外结合活性鉴定及补体凝集素途径关键组成研究以明确机制。此外，本研究中有16例患儿用过甲基强的松龙，可能对ficolin的表达有一定影响。在激活补体的凝集素组分中，H-ficolin是最有效的补体活化剂，而L-ficolin和MBL激活补体的能力只有H-ficolin的一半[14]，本组L-ficolin在血浆中表达稳定，在MPP患儿急性期和恢复期无明显差异，可能与L-ficolin和MP结合活性低或受H-ficolin触发的补体激活中间产物抑制而不能充分诱导补体激活有关，该推测也有待进一步研究证实。

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（本文编辑：沈昱平）

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本刊编辑部

Serum H-ficolin and L-ficolin levels in children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia

NAN Ziqing，HUA Chunzhen，WANG Xiaofang，et al.Department of Pediatrics，the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University，Hangzhou 310015,China

Objective To determine serum H-ficolin and L-ficolin levels in children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia(MPP). Methods The levels of serum H-ficolin and L-ficolin at acute and convalescent stages were determined by ELISA in 85 children with MPP. Results The mean H-ficolin level at the acute stage was (11.9±5.9)μg/ml(1.8～25.2μg/ml), which was significant higher than that at the convalescent stage(10.1±5.7)μg/ml(0.3～26.5μg/ml,Z=2.161,P=0.031).The mean L-ficolin levels at the acute stage and convalescent stage was (4.5±2.3)μg/ml(0.2～10.6μg/ml)and (4.6±2.2)μg/ml (0.03～10.2μg/ml),respectively(t=0.245,P=0.807).In acute stage serum H-ficolin level was correlated with L-ficolin level(r=0.22, P=0.039). Conclusion H-ficolin may be involved in the disease process in Mycoplasma pneumonia in children.

Mycoplasma pneumonia Pneumonia Children H-ficolin L-ficolin

2014-06-04）

浙江省医药卫生科技计划项目（2011KY A128）；杭州市医药卫生科技计划项目（2011A020）

310015 杭州师范大学附属医院儿科（南子晴、华春珍、王晓芳，华春珍现在浙江大学医学院附属儿童医院工作）；天台县人民医院儿科（庞福珍）

华春珍，E-m ai l：chunzhenhua@yahoo.com