韩　伟，刘　曦，黄伯骏

(华东理工大学 中药现代化工程中心，上海　200237)



Box-Behnken响应面法优化枇杷叶熊果酸的提取工艺

韩伟，刘曦，黄伯骏

(华东理工大学 中药现代化工程中心，上海200237)

摘要：以枇杷叶熊果酸得率为指标，选取乙醇体积分数、液固比、微波辐射时间和超声时间4个对熊果酸得率影响较大的因素，采用Box-Behnken响应面设计法对熊果酸的微波辅助超声提取工艺进行优化，建立多元回归方程，并进行预测分析.结果显示：当乙醇体积分数为78.5%、液固比为24.4 mL/g、微波时间为204 s、超声时间为74 min时，熊果酸的得率为10.443%；乙醇体积分数、微波辐射时间和超声时间为熊果酸提取过程中的显著因素，乙醇体积分数、液固比和微波辐射时间的二次项对得率的响应曲面有非常显著的影响，超声时间分别与乙醇体积分数、液固比之间的交互作用显著.

关键词：枇杷叶；熊果酸；微波辅助超声提取； Box-Behnken设计；响应面

枇杷叶作为一种药用历史悠久的止咳、化痰、平喘药[1]，具有清肺化痰、消炎镇痛[2]、止咳止呕、和胃降逆、提高免疫力[3]等多种功效.根据近年来的药理研究表明，枇杷叶中所含的熊果酸是枇杷叶的主要活性成分，作为一种天然的弱酸性五环三萜类化合物，其具有保护肝脏[4]、降低血糖[5]、消炎止痛[6]、抗癌、抗氧化[7-8]、治疗抑郁症[9]等多种药理作用，具有很大的药用价值.目前已有的熊果酸的提取方法包括溶剂萃取法、热回流法[10]、索氏提取法[11]、超临界CO2提取法[12]等.

Box-Behnken实验设计是一种评价指标与因素间非线性关系、解决多变量问题的设计方法，其通过所得到的实验值，建立多元二次回归方程，拟合因素与效应值之间的函数关系，并通过方差分析与响应面寻求最佳工艺参数，确定各因素对效应值的影响以及不同因素之间的相互作用关系[13].该方法不需要连续进行多次实验，因此在因素数相同的情况下，实验组合数比中心组合设计和正交设计法更少、更经济，并且使用方便，条件预测性能优良，广泛应用于中药提取、分析检测、化学合成以及生物工程等领域[14].本研究采用Box-Behnken响应面法对微波辅助超声提取枇杷叶熊果酸过程的主要参数进行优化，并对该工艺过程进行预测.

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1主要原料与试剂

枇杷叶，产地浙江，购于上海华宇药业有限公司；熊果酸标准品，购于上海同田生物有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸、无水乙醇，均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司.

1.1.2主要仪器设备

紫外分光光度计(UV1900PC)，上海亚研电子有限公司；微波提取装置(ER-692型)，中国电子器件工业总公司；超声提取装置(SK3310HP)，上海科导超声仪器有限公司；智能数显恒温水浴锅(HH-4)，巩义市予华仪器有限公司；恒温干燥箱(101-0型)，沪南电炉烘箱厂；移液管、具塞刻度试管、三口烧瓶、量筒、比色皿、布氏漏斗等，上海坛玻玻璃仪器厂.

1.2实验方法

1.2.1提取方法

称取枇杷叶3 g置于250 mL三口烧瓶，加入乙醇溶液，在微波装置提取后再置于超声波装置中提取，冰浴冷却后，减压抽滤，取滤液待测.

1.2.2分析方法

本实验采用香草醛-高氯酸显色法对枇杷叶中的熊果酸质量浓度进行分析，并在545 nm下置于紫外-可见光分光光度计中进行吸光度值的检测.

1.2.3计算方法

依据1.2.2中的分析方法对枇杷叶中熊果酸物质进行检测，得到相应的吸光度值A，并利用标准曲线的回归方程计算出熊果酸质量浓度，从而进一步计算其得率：

其中：C为样品中熊果酸的质量浓度(mg/mL)，V为提取溶剂用量(mL)，M为枇杷叶的质量(g)，n为溶液稀释倍数.

2结果与分析

2.1标准曲线的建立

采用熊果酸标准品溶液，以相应显色试剂作空白对照，在545 nm的波长下进行检测，并以熊果酸质量浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示.

由图1可知，其线性回归方程为：A=42.947C+0.0118，线性浓度范围为0.001 04~0.018 72 mg/mL，R2=0.9995，说明熊果酸质量浓度C与吸光度值A具有良好的线性关系.并且经过实验考察，具有良好的精密度、重现性和稳定性.

2.2Box-Behnken设计优化熊果酸提取工艺

2.2.1Box-Behnken试验设计方案

本文选取乙醇体积分数、液固比、微波辐射时间和超声时间4个因素，采用Box-Behnken设计，对这4个因素之间的交互作用进行进一步考察.其中，每个因素选取3个水平，分别用-1、0、1表示，然后对选定的4个因素进行编码，结果见表1.

表1　Box-Behnken设计的试验因素水平及编码

同时，采用Design Expert-8设计软件，选择中心点重复试验为5次，设计交互作用试验29组，得到试验结果.

表2　Box-Behnken 设计的试验因素水平及编码

2.2.2回归方程的建立与方差分析

利用Design Expert-8软件，以表2中枇杷叶中熊果酸得率为对象，建立多元回归方程如下所示，并进行方差分析.

Y=10.17+0.53X1-0.038X2+0.70X3+0.055X4-0.064X1X2-0.0085X1X3-0.12X1X4+

表3　拟合方程的方差分析和因素显著性检验

续表3

从表3中可知，FModel=121.74，PModel<0.0001，说明该二次回归方程是极显著的，模型F值发生噪声的概率不到0.01%.F线性=26.50，P线性<0.0001，说明该拟合方程的线性关系显著.F失拟=1.20，P失拟=0.0621>0.05，表明相对于纯误差，失拟现象不显著，方程的拟合状况良好，可用于分析和预测本文的提取工艺.

因此，根据上述分析，剔除二次回归方程中影响不显著的因素，得到简化方程如下：

2.3响应面分析

2.3.1乙醇体积分数与液固比的响应面曲线分析

由图2可知，设定X3与X4为0时，得率(Y)随着乙醇体积分数(X1)的增加而显著增大.当乙醇体积分数(X1)较低时，得率(Y)随着液固比(X2)的增加先增大而后减小，当乙醇体积分数(X1)较高时，得率(Y)随液固比(X2)的增加而减小.因此，在一定的微波时间和超声时间下，适当增加乙醇体积分数与合适的液固比有利于熊果酸得率的增加.同时根据熊果酸得率的变化可以看出，乙醇体积分数(X1)对得率(Y)的影响大于液固比(X2)，但二者的交互作用并不显著.

2.3.2乙醇体积分数与微波辐射时间的响应面曲线分析

图2　Y=F(X1,X2)的响应面曲线图与等值线图

由图3可知，设定X2与X4为0,得率(Y)随着乙醇体积分数(X1)的增加而增大，同时得率(Y)也随着微波时间(X3)的增加而呈上升趋势.因此，在一定的液固比和超声时间下，增加乙醇浓度与延长微波时间均可以提高熊果酸的得率.同时乙醇体积分数(X1)与微波时间(X3)对得率(Y)的影响均十分显著，但是二者的交互作用并不显著.

2.3.3乙醇浓度与超声时间的响应面曲线分析

图3　Y=F(X1, X3)的响应面曲线图与等值线图

由图4可知，设定X2与X3为0.当超声时间(X4)较短时，得率(Y)随着乙醇体积分数(X1)的增加而显著增大，当超声时间(X4)较长时，随着乙醇体积分数(X1)的增加，得率(Y)先迅速增加而后趋于平缓，最后呈下降趋势.当乙醇体积分数较低(X1)时，得率(Y)随着超声时间(X4)的增加而小幅增加，当乙醇体积分数(X1)较高时，得率(Y)随着微波时间(X3)的增加而基本保持不变，甚至略微下降.因此，在一定的液固比和微波时间下，适当地增加乙醇体积分数，并且选择合适的超声时间，可有效地提高熊果酸得率.并且乙醇体积分数(X1)对得率(Y)的影响大于超声时间(X4)，二者的交互作用显著.

2.3.4液固比与微波辐射时间的响应面曲线分析

图4　Y=F(X1, X4)的响应面曲线图与等值线图

由图5可知，设定X1与X4为0.当微波时间(X3)较短时，得率(Y)随着液固比(X2)的增加先增大后减小，但变化不显著；当微波时间(X3)较长时，随着液固比(X2)的增加，得率(Y)基本保持不变.同时，得率(Y)均随着微波时间(X3)的增加而增加，并且增幅明显.因此，在一定的乙醇体积分数和超声时间下，合适的液固比与较长的微波时间均对枇杷叶中熊果酸的提取有利.并且微波时间(X3)对得率(Y)的影响大于液固比(X2)，二者无显著的交互作用.

2.3.5液固比与超声时间的响应面曲线分析

图5　Y=F(X2, X3)的响应面曲线图与等值线图

由图6可知，设定X1与X3为0.当超声时间(X4)较短时，得率(Y)随液固比(X2)的增加先增大后减小，但变化不明显；当超声时间(X4)较长时，随着液固比(X2)的增加，得率(Y)先保持不变，而后呈下降趋势.当液固比(X2)较小时，得率(Y)随着超声时间(X4)的增加而增大，当液固比(X2)较大时，得率(Y)基本无变化.因此，在一定的乙醇浓度和微波时间下，为了提高枇杷叶熊果酸的得率应选择适中的液固比与超声时间.并且液固比(X2)对得率(Y)的影响小于超声时间(X4)，二者的交互作用较为显著.

2.3.6微波辐射时间与超声时间的响应面曲线分析

图6　Y=F(X2, X4)的响应面曲线图与等值线图

图7可知，设定X1与X2为0,得率(Y)随着微波时间(X3)的增加而增大，但是超声时间(X4)对得率(Y)的影响很小.因此，在一定的乙醇体积分数和液固比下，较长的微波时间十分有利于提高枇杷叶熊果酸的得率，并且微波时间(X3)对得率(Y)的影响远大于超声时间(X4)，二者的交互作用不显著.

2.4提取工艺的优化与验证

图7　Y=F(X3, X4)的响应面曲线图与等值线图

根据Design Expert-8软件的计算结果可得微波辅助超声提取枇杷叶熊果酸的最佳工艺参数与理论得率，结果如表4.

表4　提取工艺参数的优化

根据提取工艺参数优化的实验结果，进行验证试验和重复性考察，得到熊果酸的平均得率(即真实最佳得率)为10.443%，SD=0.159，RSD=1.527%(<3%)，与理论得率10.639%相差1.841%(<3%)，结果表明Design Expert-8对于熊果酸得率的预测具有较高的准确率，因此可以很好地优化枇杷叶熊果酸的提取工艺条件.

3结论

1) 本研究选择乙醇体积分数、液固比、超声时间和微波时间4个对熊果酸得率影响较大的因素进行Box-Behnken设计，建立相应的二次回归方程.通过方差分析和响应曲面分析发现，乙醇体积分数、微波辐射时间和超声时间为熊果酸提取过程中的显著因素，并且它们的二次项对熊果酸得率的响应面曲线有非常显著的影响.同时，超声时间分别与乙醇体积分数、液固比之间的交互作用显著.

2) 通过Box-Behnken设计对枇杷叶熊果酸提取工艺的重要影响因素进行优化：乙醇体积分数为78.5%，液固比为24.4 mL/g，微波辐射时间204 s，超声时间74 min，由此得到的熊果酸得率的平均值为10.443%，与实验预测值仅相差1.841%，表明该设计方法可用于熊果酸提取工艺的分析和预测，并具有较高的可靠性.

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(编辑崔思荣)

Optimal Extraction of Ursolic Acid from Loquat Leaves by

Box-Behnken Design and Response Surface Method

HAN Wei,LIU Xi,HUANG Bo-jun

(Engineering Center for Tradition Chinese Medicine Modernization，

East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China)

Abstract:Taking the ursolic acid yield of loquat leaves as an index and four factors including ethanol concentration,liquid-solid ratio,microwave radiation time and ultrasonic time as the most influential parameters,this paper established the multiple regression equation with predictive analysis to optimize the microwave-assisted ultrasonic extraction by Box-Behnken design and response surface method.The result showed that the best yield of ursolic acid was up to 10.443% with ethanol concentration at 78.5%,liquid-solid ratio of 24.4 mL/g,ultrasonic time of 74 min and microwave radiation time of 204 s.Meanwhile, the ursolic acid yield was significantly influenced by ethanol concentration, microwave radiation time and ultrasonic time during the extraction process.The response surface was dramatically affected by ethanol concentration,liquid-solid ratio and microwave radiation time.The interactions were prominent among ultrasonic time, ethanol concentration and liquid-solid ratio.

Key words:loquat leaves; ursolic acid; microwave-assisted ultrasonic extraction; Box-Behnken design; response surface

中图分类号：R284.2

文献标志码：A

文章编号：1674-358X(2015)01-0001-08

作者简介：韩伟(1968-)，男，江苏宝应人，教授，博士，博士生导师，主要从事天然产物的提取、分离及功能研究.

基金项目：国家自然科学基金项目(20006003)；华东理工大学本科教育教学改革项目(2013)

收稿日期：2014-11-08