周仁芳， 胡朝军， 李永哲

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院风湿免疫科 风湿免疫病学教育部重点实验室，北京 100730)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(4)：385- 389

自身抗体作为自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AID)的血清学标志，其中抗核抗体(antinuclear antibodies，ANA)是临床应用最广泛、最基础的一组自身抗体，已在临床应用60多年。ANA常见于系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、干燥综合征(Sjogren’s syndrome，SS)、系统性硬化病(systemic sclerosis，SSc)、混合结缔组织病(mixed connective tissue disease，MCTD)及多发性肌炎(polymyositis，PM)/皮肌炎(dermatomyositis，DM)等系统性AID患者。同时ANA也可见于器官特异性AID患者(如自身免疫性肝病等),甚至可存在于慢性感染、肿瘤及健康人群中。检测ANA对AID的诊断、鉴别诊断、分型及活动性监测等具有重要的临床意义[1]。近年来，尽管ANA在AID临床应用中取得重大进步，但仍存在标准化和正确应用的新挑战。

ANA的标准化

术语概念的标准化

由于细胞核是ANA靶抗原所在的最重要的结构部位，所以传统意义上的ANA指的是抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称。随着ANA检测技术的改进，尤其是培养细胞抗原基质(如HEp- 2细胞)的广泛应用，对ANA的认识已不仅局限于细胞核成分的自身抗体。ANA靶抗原成分已由细胞核扩展到整个细胞成分，包括细胞核、细胞质、细胞骨架及细胞分裂周期蛋白等[2]。因此，ANA术语概念已经落后并且容易引起混淆，不能完全涵盖相关自身抗体。对于ANA术语概念的标准化问题也引起诸多学者的关注。对此，经过实验室专家和临床医师讨论形成的有关ANA检测的国内外专家建议指南中，均指出ANA是以细胞的各种成分为靶抗原的自身抗体总称(anticellular antibodies)[3- 4]。但由于大部分学术著作、教科书、诊治指南及疾病诊断标准等仍采用传统的ANA术语概念，所以标准化的ANA新术语概念被医务工作人员广泛接受，仍需要一段时间的适应过程。

同样，目前对于以HEp- 2细胞为实验基质的间接免疫荧光法(indirect immune fluorescence，IIF)检测ANA，其荧光模型命名和描述术语缺乏标准化，不同的行业学会和专家建议指南采用不同的分类命名原则和描述术语[3- 4]。因此，如何实现IIF-ANA荧光模型命名和描述的标准化显得尤为重要，这也是实现IIF-ANA检测结果在不同实验室间互认的前提。在第12届自身抗体和自身免疫国际研讨会(International Workshop on Autoantibodies and Autoimmunity，IWAA)召开期间，就专门成立了ANA荧光模型国际共识(ICAP)，提出关于ANA荧光模型标准化命名的第一个国际共识[5]。

检测方法的标准化

1958年，Frious建立间接免疫荧光法检测ANA(IIF-ANA)，是ANA检测的里程碑。40多年前以HEp- 2细胞为实验基质的IIF-ANA建立，使ANA对系统性AID(特别是SLE、SSc等)诊断发生了革命性的变化。近些年，随着ANA检测的临床推广应用，经典的IIF-ANA受到其他检测方法学的挑战。发展了基于纯化抗原、重组抗原及人工合成肽，简单、快速、易自动化的酶法、化学发光法及免疫微球等检测方法[6]。但由于上述方法学存在针对不同的抗原靶位，具有不同的敏感性和特异性，从而导致ANA检测标准化的缺乏和结果合理解释问题[3]。对此，IIF仍然被美国风湿病学会、欧洲自身免疫标准化促进会及国内的专业学会推荐为ANA检测的参考方法或首选方法[3- 4,7]。

另外，由于IIF-ANA也存在方法学的局限性，如实验操作的费时、费力及工作效率难以提高，结果判读的主观性影响及特殊培训等，也限制了IIF-ANA的临床推广应用。对此，随着生物工程技术的飞速发展，已可以提供IIF-ANA的自动化方案，它不仅包括实验操作的自动化(前处理)，也包括实验结果的自动判读。目前，此类自动化仪器对ANA阴/阳性判读具有较高的诊断效能，对典型的ANA荧光模型具有较好的识别能力，能减少ANA检测结果在实验室的室内、室间差异，且能提高实验室IIF-ANA 的工作效率[8]。同时，仪器制造商也正在积极开发新的软件系统，以实现更好的自动识别荧光模型和光信号相关滴度的最终判断。未来这些新技术可避免人为判断ANA滴度进行的血清稀释，从而对提高经济效益和工作效率具有重要的意义。因此，实现IIF-ANA检测的自动化对其标准化进展起重要的推动作用[3]。

检测程序的标准化

在ANA检测方法中，根据多级诊断程序(multistage diagnostic process)，分成总抗体的筛查试验和特异性自身抗体的确认试验。由于不同方法存在靶抗原特点、敏感度及特异度差异，造成筛查试验和确认试验结果的不一致性。因此ANA筛查试验与特异性自身抗体确认试验的检测程序问题一直是备受关注的话题。在笔者以往的研究中，发现对IIF-ANA总抗体的筛查试验和15项ANA特异性自身抗体线性免疫印迹法(line immune assay，LIA)的确认试验进行平行检测分析时，两者结果存在不一致。对此，提出在ANA临床检测中可先用筛查试验(IIF-ANA)进行ANA筛查，若阳性需进一步进行ANA特异性自身抗体检测，为疾病确认提供依据。另外，由于检测方法敏感度及靶抗原特点，可存在IIF-ANA阴性而特异性自身抗体阳性的情况。

因此，当IIF-ANA阳性时，需对ANA特异性自身抗体进行进一步检测；当临床高度疑似，不论ANA检测结果如何，都需要对特异性抗体进行检测。例如，临床疑似炎症性肌病需检测抗Jo- 1抗体，临床疑似SLE需检测抗核糖体P蛋白抗体，临床疑似先天性心脏传导阻滞/新生儿狼疮/SS/亚急性皮肤型狼疮需检测抗SSA抗体[3]。

结果报告的标准化

ANA对AID的临床应用价值毋庸置疑，但如何规范检测结果报告，仍是临床实验室面临的一大问题。对此，第2届ANA ICAP研讨会达成共识[9]，IIF-ANA检测结果报告应包括：方法、结果(阳性/阴性、荧光模型、滴度)及建议(临床相关性、进一步选择的特异性抗体检测)。还应有适合各实验室的参考区间和临界值(cut-off值)[3- 4]。如对于ANA滴度的参考区间，以高于95%的当地健康对照人群水平被视为异常。同样，验证ANA 临界值(cut-off值)，推荐使用年龄和性别相匹配的当地健康人群血清，cut-off值应设置为第95百分位；特异性自身抗体(如抗双链DNA抗体、抗可溶性抗原抗体)cut-off值，推荐使用相关AID、疾病对照和健康对照人群的足够量标本进行验证，cut-off值需通过受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve，ROC)分析加以设置[3]。

检测试剂的标准化

目前，我国的自身抗体检测试剂存在多样化，检测质量良莠不齐的现状。不同厂家的检测试剂采用不同的抗原(如抗原特性、分布、含量等)，对ANA或其特异性自身抗体的结合能力不同，从而可导致检测结果的不一致性。同时，不同厂家的检测试剂对ANA检测结果的cut-off值设定、参考区间及检测范围的不一致性，也可导致结果的可比性差。如IIF-ANA目前仍无文献详细说明以HEp- 2细胞为实验基质的不同厂家的检测试剂的敏感性、特异性差异。另外，目前由于国内医疗保险、收费价格等因素的限制，ANA特异性自身抗体仍采用定性检测试剂为主。如厂家从市场利益出发随意进行多个项目组合的LIA-ANA特异性自身抗体检测，由于包被不同特性的靶抗原在同一反应体系中检测多种自身抗体，可导致检测项目的临床诊断效能下降。因此，如何实现ANA检测试剂的标准化，是确保检测结果准确、可靠的前提。对此，行业组织应形成检测试剂的标准化要求，专业学会应定期组织实验室进行不同厂家的检测试剂比对分析。

ANA的临床正确应用

项目的合理应用

自20世纪60年代，ANA主要应用于风湿免疫科的就诊患者，而近些年随着ANA项目的临床推广应用，已广泛应用于除风湿免疫科外的皮肤科、神经科、消化科等其他临床学科患者。在关于ANA阳性结果的临床诊断效能评价中[10]，232例ANA阳性患者中，诊断为狼疮患者为2.1%，诊断为ANA相关性风湿病(antinuclear antibody-associated rheumatic disease，AARD)患者为9.1%，说明ANA对AARD诊断为低阳性预测价值指标。另外，2012年美国国家健康和营养调查显示，美国人群中ANA总体样本阳性率为13.8%，其中女性阳性率为17.8%，男性阳性率为9.6%。因此，如何加强在临床路径管理背景下进行ANA 检测项目的合理选择，是专业学会今后需开展的引导性工作。针对自身抗体的临床应用，专家建议也指出[4]，对临床怀疑AID的患者建议进行自身抗体检测，对没有特征性AID临床表现的个体不建议进行自身抗体的筛查。

IIF-ANA荧光模型的临床应用

IIF-ANA荧光模型与其靶抗原在细胞内的分布相关。虽然荧光模型与ANA特异性自身抗体存在一定的相关性，但并非严格意义上的完全一致，不能仅从荧光模型来推断特异性自身抗体。如细胞核均质型的ANA荧光模型可能对应的是抗双链DNA抗体，但抗双链DNA抗体并不一定局限于细胞核均质型的荧光模型，同样细胞核均质型的荧光模型也并非一定为抗双链DNA抗体或见于SLE患者[11]。同时，ANA荧光模型也可作为鉴别ANA阳性的健康人群和AID患者的重要指标[12]，如细胞核均质型、粗颗粒斑点型、着丝点型荧光模型仅见于AID患者，细胞核致密细斑点型荧光模型(dense fine speckled，DFS)仅见于健康人群，细颗粒斑点型荧光模型在AID患者和健康人群中均可见，但健康人群中的阳性率低于AID患者(P<0.001)。在SLE患者的不同ANA荧光模型中，细胞核均质型与SLE患者的免疫学异常呈正相关，细胞核斑点型与SLE患者的关节炎、器官损伤呈负相关[13]。

另外，除常见的ANA荧光模型外，少见的ANA荧光模型也可与AID相关，如细胞核多点型、核膜型与自身免疫性肝病相关，细胞周期相关的荧光模型主要见于肿瘤患者[1]。DFS[14]、高尔基体型荧光模型[15]、细胞浆棒状/环状荧光模型(rods and rings，RR)[16]及疟原虫感染相关的特殊荧光模型[17]等ANA荧光模型，其相关特异性自身抗体和临床意义的研究已引起诸多实验室的关注。因此，荧光模型作为IIF-ANA检测结果的重要参数，对进行下一步特异性自身抗体的检测具有一定的指导意义，并与某些特异性自身抗体或AID的特殊临床表现存在一定的相关性。

滴度的临床应用

ANA滴度为多少才具有明确的临床意义？由于正常机体也会存在微弱的自身免疫应答，产生生理性的自身抗体，因此，健康人群(包括孕妇、老年人等)也会检测到低滴度的ANA。另外，感染性疾病、肿瘤等也会由于机体的自身免疫反应产生ANA。所以ANA阳性并非一定为AID[4,10]。同时，由于IIF检测ANA与试剂、设备和其他因素有关，ANA滴度的参考区间可因地而异。目前，虽然对于ANA滴度达到多少才具有明确的临床意义，仍无明确的结论，但文献中明确了ANA滴度越高与AID的相关性越大[3- 4]。

ANA滴度能否作为AID病情监测指标？由于ANA滴度与病情严重性没有必然联系，因此，不推荐使用ANA滴度的变化来反映AID的活动性和疗效反应性[3- 4]。但对于某些ANA特异性自身抗体，如抗双链DNA抗体滴度可作为SLE疾病活动性的监测指标之一，应定期进行监测。如对于SLE疾病活动期的患者，每隔6～12周进行抗双链DNA 抗体检测为宜，而对于病情较为稳定的患者，每隔6～12 个月进行检测即可[18]。

不同厂商试剂采用不同的滴度系统，其结果能否直接比较？由于以HEp- 2细胞为实验基质的IIF-ANA，不同厂商的检测试剂的敏感度和特异度存在差异，因此其稀释滴度系统也存在不同。目前国际上诸多实验室常采用1∶40、 1∶80、1∶160、1∶320等的倍比稀释滴度系统，但国内常采用1∶100、1∶320、1∶1 000、1∶3 200等的10的立方根为因子的稀释滴度系统。虽然上述稀释系统均有1∶320 存在，但两者的临床意义差别较大，不能直接比较，需溯源到国际单位(kU/L)后才能进行比较。

特异性自身抗体的临床应用

ANA的靶抗原包括细胞核、细胞质、细胞骨架及细胞分裂周期蛋白等150多种细胞成分，其相应的特异性自身抗体对AID的诊断与鉴别诊断、病情监测与疗效观察、病程转归与预后判断及疾病预警等方面具有重要的意义[2,10]。目前，仅有少数ANA特异性自身抗体被确定疾病相关性，且随着ANA临床应用的广泛开展，对其特异性自身抗体赋予新的解释。一方面，如抗增殖细胞核抗原抗体一直被认为是SLE的特异性自身抗体，而后发现抗增殖细胞核抗原抗体并非SLE所特有，可见于多种疾病患者如淋巴瘤、慢性乙型肝炎及慢性丙型肝炎等[19]。另一方面，新的特异性自身抗体不断被了解，如抗DFS70抗体作为DFS荧光模型的特异性自身抗体，该抗体最初发现于间质性膀胱炎，而后该抗体还见于特应性皮炎、慢性炎症性疾病、肿瘤、AID等多种疾病及健康人群中。目前，抗DFS70抗体可作为系统性AID排除诊断的实验室指标[20]。总之，对于各种ANA特异性自身抗体的确切临床意义，仍需大量流行病学资料和临床实践，才能真正明确其临床应用价值。

无临床症状者的ANA阳性情况

在ANA临床应用中，无临床症状者中的ANA阳性情况十分常见。在一项国际调查中，健康人群中存在31.7%的低滴度(1∶40)ANA阳性，5%滴度为1∶160的ANA阳性。而在另一报道中[12]，健康人群ANA的阳性率为12.9%；且40例ANA阳性的健康者经随访无一例进展为AID，其中29例(72.5%)经随访后ANA仍呈阳性。由于ANA的产生存在遗传学背景的差异，发现HLA-DRB1*0405基因(位点为rs23195)是日本人群产生ANA的易感基因，且ANA阳性的健康人群与SLE患者的基因重叠有限[21]。因此，对于无临床症状者的ANA阳性情况，大部分为机体正常的免疫反应。但是，也不可忽略ANA阳性可存在于某些AID患者的临床前期，如ANA及其特异性自身抗体(抗SSA抗体、抗SSB抗体等)可存在于SLE、SS患者出现临床症状前数年[22- 23]。对此，检测ANA可使AID的早期预警成为可能，据此学术界也提出“预测性抗体”的新概念，也是ANA及其他自身抗体检测的前景所在。

总　　结

随着ANA的临床推广应用，加强ANA的标准化，实现ANA检测的临床正确应用，使ANA被临床正确理解和合理解释，是今后临床实验室人员和临床医师共同努力的方向。

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