刘红艳，秦光军，莫凌云，易忠胜，李子院，张　飞(桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林　541004)



PFOA和PFOS对青海弧菌Q67的毒性作用评估

刘红艳，秦光军，莫凌云，易忠胜，李子院，张飞
(桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林541004)

摘要:以淡水发光菌——青海弧菌( Vibrio qinghaiensis sp. -Q67)为检测生物，应用VeritasTM微板光度计分别测定了全氟辛酸( PFOA)和全氟辛烷磺酸( PFOS)对Q67的毒性效应。结果表明:全氟辛酸为典型的S型剂量－效应关系，利用Weibull非线性函数进行曲线模拟，模拟函数可以有效估计化合物的半抑制毒性效应值EC50。全氟辛烷磺酸对Q67的毒性为非单调的U型剂量－效应关系，运用最优权重理论和三次曲线回归方法，通过SPSS统计软件对剂量－效应曲线进行拟合，得到其三次回归曲线方程。结果表明:在浓度介于( 5. 031E－4)～( 7. 133E－3) mol/L，全氟辛烷磺酸对Q67毒性效应为自稳态区域，表现为Q67的发光强度增强，即在低浓度作用条件下，PFOA对Q67的毒性表现为抑制作用，而PFOS则表现为刺激兴奋作用。

关键词:全氟辛酸;全氟辛烷磺酸;青海弧菌;剂量－效应;最优权重

表面活性剂是一大类有机化合物，它们的性质极具特色，应用极为广泛灵活，有很大的理论意义和实用价值。全氟有机化合物( fluorinated organic compounds，FOCs)［1－3］自1950年由3M公司( Minnesota Mining and Manufacturing，明尼苏达矿务及制造业公司)研制成功以来，以其优良的热稳定性、化学稳定性、高表面活性及疏水疏油性能，被广泛地应用于工业生产和生活消费领域，尤其是其代表性化合物全氟辛烷磺酸( perfluorooctane sulfonate，PFOS)和全氟辛酸( perfluorooctane acid，PFOA)以及它们的盐类更是被大量地应用在化工、纺织、涂料、皮革、合成洗涤剂、炊具制造等诸多与人们日常生活息息相关的生产中［4－5］。PFOA和PFOS具有难降解性和生物蓄积性，对生物体的组织和器官造成严重影响。大量研究表明: PFOA和PFOS对动物和人类具有神经、肝脏、遗传、生殖及其他潜在毒性［6－10］，因此被环境科学界认为是持久性有机环境污染物的新成员，其环境毒性研究越来越受到人们的重视［11－14］。本文选择PFOA和PFOS作为研究对象，研究其发光菌发光抑制效应，旨在为FOCs的环境健康与风险评价提供理论依据，并为其微生物降解提供参考依据。

1　材料与方法

1. 1主要仪器和试剂

VeritasTM微板光度计，美国Turner Biosystems公司; LS－B50L型立式压力蒸汽灭菌器，上海医用核子仪器厂; LRH－150Z型恒温振荡培养箱，广东医疗器械厂; Pipetman®型移液器( P20，2～20 μL; P100，20～100 μL; PUM12×300，20～300 μL)，法国吉尔森公司; SW－CF－IF型超净工作台，苏净集团安泰公司; BT25S型五位电子天平，德国赛多利斯公司; WZR－D961型微量振荡器，苏州市东吴医用电子仪器厂; KG23E66TI型西门子冰箱，西门子公司; LRH－150Z型恒温振荡培养箱，广东医疗器械厂; WZR－D961型微量振荡器，苏州市东吴医用电子仪器厂。

全氟辛酸、全氟辛烷磺酸均购自于Sigma公司。用五位电子天平准确称取一定量的PFOA和PFOS化合物后，用石英亚沸蒸馏水溶于100 mL棕色容量瓶中，制成浓度分别为9. 74E－3和2. 73E－2 mol/L的储备液，于4℃冰箱保存备用，存放时间不超过4个月。

青海弧菌的培养基组成:磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、七水硫酸镁、六水氯化镁、无水氯化钙和碳酸氢钠，均购自广东汕头市西陇化工厂;氯化钠和甘油，购自广东新宇化工厂;胰蛋白胨，购自北京陆桥有限责任公司;酵母浸出膏和琼脂粉，购自中国医药上海化学试剂公司。

1. 2菌种培养

淡水发光菌——青海弧菌( Q67)，购自华东师范大学，其培养方法见文献［15－16］。将装有冻干粉的安瓿瓶先置于4℃冰箱内约10～15 min，在超净工作台中切开安瓿瓶，取已灭菌的ρB= 0. 008 ( kg/L) NaCl溶液100 μL点在培养皿平板上，用接种环取一环菌种蘸取点的溶液在平板上划线，倒置放于恒温培养箱中于22℃培养24 h。挑取单个菌落接种于培养基上，于22℃培养24 h后转接于斜面，将培养好的第3代菌种置4℃冰箱中备用。再将培养好的菌种接种到50 mL液体培养基中，22℃振荡培养16～24 h (保证Q67处于对数生长期)，待用。

1. 3实验方法

应用文献［15］的方法，在96微孔板第1排每孔加入100 μL蒸馏水作空白对照。第2排12孔中分别加入不同体积的毒物溶液，不满100 μL液量的孔补以蒸馏水至100 μL。第3排与第4排加液方式同第2排，为其平行实验。最后用12道移液器从第1排到第4排向每孔加入100 μL菌液，将96微孔板放在微量型振荡器上震荡10 s后，于VeritasTM微板光度计上测定其分光度，设置运行次数为3次，每运行一次后的延迟时间为150 s。

用计算出的12个空白测量值的平均值( I0)和每个浓度的样品3次测量的平均值( I)，计算出各化合物在不同浓度下对发光菌的抑制率E

由图4可知：（1）国际经贸学院、金融管理学院、国际商务外语学院、法学院等学院的借阅人数呈现逐年递增趋势，因此采访工作的对接也需要更加重视；（2）金融管理学院、统计与信息学院的借阅人数递增趋势减缓或略有下降，可根据采访资源的实际情况合理配置这种借阅需求减少的学院。

E = ( I0－I) /I0×100%，( 1)

1. 4不同形状剂量－效应曲线的拟合方法

对实验测得的剂量－效应曲线( dose－respone curves，DRC)散点图进行数学拟合的传统方法是线性回归法，它只适用于DRC中线性部分的描述，其他部分特别是低剂量区域信息无法评价。刘树深等［15，17－18］发现的Weibull( S)、Logit( S)和Biphasic ( J)函数分别用于描述非线性函数的S型和J型曲线。经过筛选，本文的剂量－效应曲线主要用Weibull模型来描述，其函数为

E = 1－exp(－exp(α+β×log10( c) ) )，( 2)而对于低剂量刺激的U型曲线则无法用上述函数描述。为了解决浓度和抑制率之间的相关拟合程度的问题，根据统计学原理，现已发展出最优权重理论［19］用于这一领域。

关于权重的应用问题，在目前学术上大多用于组合模型理论，本研究亦如此。组合模型就是设法把不同的模型、方法组合起来，综合利用各种方法提供信息，在组合模型中赋予不同的模型或方法一定的权重。为此，组合模型最关键问题是如何确定不同模型的权重。从统计学角度讲，解决这一问题的基本原则是必须使组合模型误差最小，即赋予误差较大的模型最小权重。因此，组合模型完全有可能改善系统预测的性能，提高模型预测的精度和可靠度。

通过观察浓度与抑制率的变化数据，提取出多组数据进行曲线拟合实验，运用SPSS统计软件进行统计曲线回归分析，得出浓度和抑制率之间大体呈现三次曲线回归关系，且R2较大(大于0. 98)。故选取三次曲线回归模型以拟合浓度与抑制率之间的关系。

三次曲线回归方程为其中: E是效应; c是浓度; bi( i = 1，2，3)是方程系数。

确立组合模型权重的基本原则是必须使组合模型误差最小，即赋予误差较大的模型最小的权重。对于模型权重的确定，目前的研究主要有合成法和区域合成法两大类。权重合成法又包括平均值法、标准差法、二项式系数法、离异系数法、AHP法，使用较多的是标准差法。

权重计算公式

于是便可得到权重近似最优模型的方程为

2　结果与讨论

2. 1全氟辛酸的低剂量刺激对Q67的毒性分析

根据实验结果，以非线性最小二乘法拟合DRC曲线。根据R2选择最佳模型Weibull函数对测定的毒性数据点进行非线性拟合。表1列出了全氟辛酸的DRC模型及参数，拟合曲线与实验测定的剂量－效应散点图及其DRC模拟曲线见图1。

从表1可知，这个化合物的DRC拟合值与实验值之间的R2为0. 990 7，拟合统计性显著。拟合参数α值为9. 533 7，β值为3. 367 7，全氟辛酸的β值较大，即剂量－曲线的陡度较大，说明其毒性随浓度的增加变化较快。

表1　全氟辛酸的DRC优化模型及参数Table 1　DRC model and parameters of Perfluorooctanoic acid

图1　全氟辛酸的剂量－效应关系Fig. 61Dose response relationship for Perfluorooctanoic acid

从图1中可以直观地看出，Weibull函数可以很好地表达化合物的剂量－效应曲线。半致死浓度或半抑制率浓度是评价物质生物毒性的重要指标，半抑制浓度愈大其毒性愈小。结果表明:全氟辛酸的EC50值为1. 149E－3 mol/L，其对Q67的低剂量毒性为抑制作用，其剂量－效应曲线为典型的S型。

2. 2全氟辛烷磺酸的低剂量刺激对Q67的毒性分析

实验过程中发现，全氟辛烷磺酸对Q67的剂量－效应曲线并不能通过Weibull ( S)、Logit ( S) 和Biphasic ( J)函数来拟合，通过对多组实验数据进行最优处理和分析，将数据导入SPSS软件进行统计方差分析，求出浓度与抑制率的三次曲线回归模型的方程系数及标准误差Si。应用式( 4)进行权重理论分析，分别求出3组数据的权重Ki，然后根据式( 5)可求出组合三次曲线回归方程

E = 0. 125 064－272. 194c + 47 859. 08c2－

1 705 249c3。( 6)通过计算得到抑制率的拟合值，将数据导入SPSS统计软件进行三次曲线拟合，得到全氟辛烷磺酸对Q67的剂量－效应曲线(图2)。

图2　全氟辛烷磺酸的DRC关系Fig. 62Dose response relationship for Perfluorooctane sulfonate

由图2可知，其剂量－效应曲线呈现“U”型曲线。一般认为，大多数类型的毒性反应具有阈剂量。所谓阈剂量［20］，是指在剂量－效应关系中存在着一个剂量，低于此剂量个体反应几率为零。而在图2中，当浓度大于或小于阈剂量时，全氟辛烷磺酸对Q67产生毒性作用加强，发光强度减弱，浓度介于( 5. 03E－4)～( 7. 13E－3) mol/L时，对Q67的毒性作用几乎可以说为零或更低，即发光菌中的萤光素酶数量有所增加，从而使Q67的发光强度增强。当浓度大于7. 13E－3 mol/L时，对Q67的低剂量毒性表现为抑制作用，其EC50值为1. 009E－2 mol/L。

就本实验而言，全氟辛烷磺酸对发光菌抑制率低于阈剂量［20］时，将不抑制发光菌的发光;高于阈剂量，将抑制其发光。阈剂量效应的以下范围，被称为自稳态区域，即图2中抑制率为零以下的区域，在该区域内样品对发光菌发光无抑制，而是促进生长，这与加入样品后发光菌发光体系性质变化有关:首先，发光菌的发光是一种生理过程，受体系氧化还原电位、H+与OH－浓度的影响;其次，样品的加入，打破了原体系的发光平衡，加之样品自身特性，这些外因对体系的共同作用，在某种程度上激发了发光菌荧光酶活性(或激发发光菌发光活性)。这种激发不是在某个剂量点的行为，而是一定的剂量范围。样品在这个剂量范围内，对发光菌的发光代谢均起到促进作用。这种促进作用又有所不同，以最大促进生长点ECmin(即图2中曲线部分的最低点)为分界，在该点的左侧随样品剂量的增大，促进作用增强;在ECmin点的右侧随剂量的增大，促进作用减弱。

3　结论

以青海弧菌为指示生物，用VeritasTM微板光度法测定了全氟辛酸和全氟辛酸磺酸两个化合物对Q67的抑制毒性，其中全氟辛酸化合物对Q67的剂量效应曲线可用Weibull函数表征，运用非线性最小二乘技术进行剂量－效应曲线拟合。拟合结果与实验结果之间的R2为0. 990 7，拟合统计性显著。同样测定了全氟辛酸磺酸对Q67的抑制毒性，而全氟辛烷磺酸对Q67的剂量－效应曲线不能通过常用的Weibull( S)、Logit( S)和Biphasic ( J)函数来拟合，因此通过对多组实验数据进行最优处理，采用最优权重理论，运用三次曲线回归模型拟合其剂量－效应曲线，结果表明全氟辛烷磺酸的低浓度对青海弧菌Q67具有刺激兴奋作用，即浓度介于( 5. 031E－4)～( 7. 133E－3) mol/L时Q67的发光强度增强，即在这两者之间其对发光菌Q67的毒性作用为自稳态区域。研究结果表明在低浓度作用条件下，PFOA对Q67的毒性表现为抑制作用，而PFOS则表现为刺激兴奋作用。

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Evaluation of aquatic toxicity for PFOA and PFOS to Vibrio qinghaiensis sp. -Q67

LIU Hong-yan，QIN Guang-jun，MO Ling-yun，YI Zhong-sheng，LI Zi-yuan，ZHANG Fei
( College of Chemistry and Bioengineering，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China)

Abstract:In freshwater luminescent bacteria ( Vibrioqinghaiensis sp. -Q67) for biological detection，the inhibition toxicity of perfluorinated octylic acid ( PFOA) and perfluorinated octane sulfonic acid ( PFOS) to Q67 was tested by VeritasTMphotometer．In Weibull nonlinear function curve simulation，the dose-response relationship of PFOA in Q67 was typical S-type curve．The simulation function can effectively estimate semi-inhibition effect value ( EC50) of compounds．The inhibition curve of perfluorooctane sulfonate in Q67 was non-monotonic U-type curve．The dose-response curve was finished by the optimal weight curve theory and three regression curve equation with SPSS statistical software．The results show that the toxicity effect of PFOS on the Q67 has a lowdose stimulating effect when the concentration was between 5. 031E－4 mol/L and 7. 133E－3 mol/L．There is homeostasis region，and the luminescence intensity of Q67 is enhanced．The study shows that under the condition of low concentration effect，PFOA toxicity of Q67 characterizes inhibition，whereas PFOS performs stimulative effect．

Key words:perfluorooctanoic acid; perfluorooctane sulfonate; Vibrio qinghaiensis sp. -Q67; dose-effect; optimal weight

作者简介:刘红艳( 1970—)，女，硕士，副教授，研究方向:污染物毒理学，lhyglite@126. com。

基金项目:国家自然科学基金项目( 21207024; 21467006) ;广西自然科学基金项目( 2011GXNSFA018059)

收稿日期:2014－03－19

doi:10. 3969/j．issn. 1674－9057. 2015. 01. 019

文章编号:1674－9057( 2015) 01－0121－05

文献标志码:A

中图分类号:X131

引文格式:刘红艳，秦光军，莫凌云，等．PFOA和PFOS对青海弧菌Q67的毒性作用评估［J］．桂林理工大学学报，2015，35 ( 1) : 121－125．